酱香型白酒发酵过程中微生物多样性研究进展

李巧玉，谭方根，焦 富，牟明月

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564501）

白酒是中华民族具有传统特色的饮料酒，主要采用粮谷等为原料，以酒曲、活性干酵母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成，其独特的生产工艺和风味特征使得其在国际上也享有较高声誉，为世界六大蒸馏酒之一。同时，因酿造原料、生产工艺及自然环境等因素的不同，导致参与酿造过程的微生物菌群结构不同，最终形成了各具风格特色的12种不同香型。

“曲乃酒之魂”，大曲作为发酵剂为白酒发酵过程提供丰富的微生物及酶系，酒醅中微生物群落的结构稳定及其生长、代谢对白酒风味形成起着重要的作用。目前，各研究者针对中国白酒酿造中微生物多样性、固态发酵工艺的复杂性和风味化合物的丰富性这3 个典型特征，基于风味导向技术对中国白酒微生物发酵特征及代谢风味物质调控进行了研究，将对白酒的研究从传统微生物学研究深入到分子微生物学层面，从经验型的操作应用提升到风味导向下的微生物定向代谢风味品质调控的微生物代谢组学层面。细菌作为酱香白酒主要微生物类群之一，是发酵生香的动力来源，酵母直接关系到产酒率，且能够代谢产生大量不同的风味物质，对酱香型白酒风格的形成具有重要作用。大曲及酒醅中的微生物直接参与了酱香型白酒风味物质的形成，因此微生物菌群的种类及数量对白酒风味及香型形成极其重要，本文基于此对酱香型白酒发酵过程中的微生物多样性进行研究方法综述，为进一步从微生物的角度理解酱香型白酒的发酵机理提供参考。

1 微生物多样性研究方法进展

1.1 微生物传统培养法

传统微生物培养法是根据目标微生物对碳源、氮源、生长因子等不同营养物质的需求，在培养基中加入相应比例的营养成分，进行定时定温培养，然后通过形态观察，并结合生理生化特征等进行鉴定，分析不同可培养微生物的种类和数量。王晓丹等利用传统微生物培养法从酱香型白酒酒醅中分离筛选得到和，通过纯培养研究得出上述两株菌分别具有产乙酸乙酯和产乙酸苯乙酯的功能。传统微生物培养法有利于了解分离纯化得到的微生物的形态特征和生理特性，对有价值的微生物进行保藏、应用等，但该方法在实际应用中工作量大、流程繁琐，且人工模拟的环境与酱香型白酒发酵过程中微生物的生长环境存在一定偏差，仅对占微生物总数0.1 %～10 %的可培养微生物进行分析，不能准确反映微生物在自然状态下的群落组成、分布及变化特征。

1.2 微生物免培养法

1.2.1 化学的非培养方法

化学的非培养方法就是指非培养的生理生化方法。这种方法的实现主要有两种，一种是脂肪酸甲酯与磷脂脂肪酸分析法，另一种是由美国Biolog公司开发出Biolog 法。脂肪酸甲酯与磷脂脂肪酸分析法基于微生物的组成中存在的磷酸。磷酸是微生物细胞膜的重要组成成分，具有特异性，因此人们可以用放射性元素对微生物的细胞膜进行标记，然后分析提取出含有标记物的磷酸，进而分析得知此种微生物在取样环境中的分布与含量。Biolog 法的原理是在微平板上的反应孔中有不同碳源和四唑盐染料，微生物在利用碳源的过程中产生自由电子，与染料发生还原显色反应，颜色的深浅可反映微生物对碳源利用能力的差异，以此鉴定纯种微生物或比较分析不同的微生物群落，具有直观、快捷的特点，因此常用于微生物分类鉴定分析。化学非培法相比较传统的微生物培养分析手段，能较为全面的分析体系中可培养和不可培养微生物，并且更详尽地反映微生物的变化和波动情况，但因涉及的化学试剂较多，对环境及样品的影响较大，常用于院校或科研机构对微生物多样性的研究，较少应用于食品生产过程在制品分析。为使微生物鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定，研究者在传统的微生物实验鉴定技术的基础之上，利用基因序列同源性分析，建立一种客观、灵敏、快速的微生物多样研究方法。

1.2.2 基因指纹图谱分析法

随着DNA 提取技术、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术的不断发展，分子生物学技术越来越广泛地应用于微生态学的研究，为发酵食品微生物群落多样性的研究带来了良好的契机。基因指纹图谱技术是基于核酸分子成分、大小和构型上的差异，利用电泳方法将不同的核酸分子分离，形成不同分子量的基因条带图谱，根据图谱上条带信息进行基因分析的技术。基因条带图谱中，每个条带代表不同的操作分类单位（Operational Taxonomy Unit，OTU），条带数量反映微生物种群的多样性和相对丰度。原核微生物多样性分析以核糖体基因序列（Ribosomal gene sequences，rRNA）为研究对象，16S rRNA 基因具有高度的保守性和高变异性，保守性能够反映生物物种的亲缘关系，高变异性则能反映生物物种特征核酸序列的差异性，拥有丰富的数据库等优点。真核微生物多样性研究主要基于18S rRNA 基因、26S rRNA 基因和5.8S rRNA 间隔区（ITS 间隔区）的扩增和分析。王莉等通过扩增酱香型白酒窖底泥样本中细菌16S rDNA 的V6 区并采用Illumina高通量测序平台进行深度测序发现，随着窖底泥的不断驯化，、和等厌氧微生物逐渐成为主要优势种群。目前，基因指纹图谱技术在发酵食品微生物多样性分析中应用较广泛。

1.2.3 宏基因组学

宏基因组学（Metagenome）又称元基因组学、环境（生态）基因组学、群落基因组学，是一种不依赖于人工分离培养的微生物基因组技术。Handelsman 等将宏基因组学定义为：以某一特定环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、寻找新基因、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基因组学研究常采用稳定同位素探针技术（Stable isotope probe technique，SIP）实现目的基因组的富集，根据样品的类型制定相应的DNA 或RNA 提取方法，研究者发现叠氮溴化乙锭（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）或叠氮溴化丙锭（Propidium monoazide，PMA）中的叠氮化物基团被光解并发生C—H 插入反应可与DNA形成共价键，从而产生永久性的DNA 修饰。EMA和PMA 无法通过功能完整的细胞膜，仅能与暴露的DNA 相结合，因此可用来选择性地修饰来自死亡细胞的暴露DNA，同时保留来自活细胞的完整DNA，从而去除环境样品群落中死亡微生物的DNA，达到高效提取高质量基因组的目的。构建的基因组文库可根据活性物质进行功能筛选，或根据已知序列设计特异性PCR引物、杂交探针进行序列分析筛选，通过宏基因组测定对待研究样品的功能进行分析。宏基因组技术的发展，为研究白酒酿造微生物多样性提供了新的方法和手段。目前，宏基因组学技术因解析微生物种群间的相互协作作用，常应用于发掘白酒大曲微生物资源及大曲酒生产相关酶类（淀粉酶、酯酶、蛋白酶、脂肪酶、氧化还原酶等新功能酶）的研究，为新功能酶类应用于大曲酒酿造过程中提供技术支撑。

2 酱香型白酒发酵过程中微生物多样性研究进展

2.1 细菌多样性

高温大曲作为酱香型白酒发酵剂，其中原核微生物种属较多，主要是由、和等菌群构成，菌株在发酵过程中利用原料生成大量的呈香呈味物质及其前体。吕锡斌等通过高通量测序技术分析酱香型白酒下造沙轮次的微生物多样性发现：下沙、造沙轮次分别检测到203 个、184 个细菌属。下沙轮次发酵过程中主要细菌属为、、、、，其中丰度最高；造沙轮次发酵过程中主要细菌属为、、、、、、，其中丰度最高。胡小霞等利用高通量测序等方法分析了酱香白酒一轮次堆积和窖池发酵酒醅中的细菌菌群结构，结果显示，堆积发酵过程中、和占主要优势。黄蕴利等采用高通量测序技术解析了酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系，结果表明，堆积过程中绝对优势细菌属有、、、，在窖内发酵酒醅中绝对优势细菌属为。酱香型白酒酿造过程中优势细菌属见表1。

表1 酱香型白酒酿造过程中优势细菌属

2.2 真菌多样性

大曲中的真核微生物主要是和。主要有和等；主要是（、、）、（、、、）、、、等；吕锡斌等通过高通量测序技术分析酱香型白酒下造沙轮次的微生物多样性发现：下沙、造沙轮次分别检测到160 个、109个真菌属。在下沙轮次发酵过程中主要真菌属为、、、、，其中丰度最高；造沙轮次主要真菌属为、、、、。黄蕴利等采用高通量测序技术解析了酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系，结果表明，堆积过程中绝对优势真菌属有、、、；在窖池发酵酒醅中绝对优势真菌属为、、、。郭敏等通过高通量测序技术分析酱香型白酒三轮次微生物多样性发现，、、、是酱香型白酒发酵过程绝对优势的真菌微生物属。酱香型白酒酿造过程中优势真菌属见表2。

表2 酱香型白酒酿造过程中优势真菌属

2.3 微生物种群间的相互作用与影响

种群是微生物的基本生存单位，执行相关代谢功能的种群组合在一起形成了微生物系统。酱香型白酒所采用的糖化发酵剂主要由高温大曲组成，曲所带入的微生物种群不同，加之开放式的生产工艺，酿造环境中微生物必将进入发酵体系，从而形成了酿造微生物的多样性与复杂性。经过多年的实践与探索，范光先等认为，酱香型酿造微生物区系平衡的研究成果对酱香型白酒酿造工艺有着指导意义。陈笔等研究发现，和是酱香型白酒发酵过程的优势霉菌，将XJ10 与混合发酵，最终发酵液中的酿酒酵母的生物量以及乙醇产量，酯类、醛酮类、乙酸乙酯等风味物质浓度均有不同程度的增加。许焰等将来源于茅台酱香型白酒酒醅的4 种菌株CGMCC4745、CCTCCM2014463、CGMCC3962 及共培养发现的生长受到的抑制作用，但几乎不受及的抑制，分析原因可能为产生的乙醇、有毒化合物或者营养竞争作用抑制了的生长。在酱香型白酒发酵过程中微生物种群间相互作用，导致代谢产物的多样性与复杂性，给研究带来很大的困难，通过实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）技术实现系统中微生物的原位分析，认识微生物结构与功能的关系，通过调控种群结构达到系统功能的最佳状态，从而建立适用于中国白酒微生物菌群研究的新方法。

3 展望

白酒酿造微生物多样性的研究，多年来一直是行业热点，但是对于微生物群落和多酶体的整体认识是片面的，影响行业人士对微生物代谢机理及功能性成分的系统认识。采用高通量测序技术，解析白酒酿造发酵过程中微生物的群落演替及相互作用，同时借助代谢组学对微生物代谢产量进行定性、定量分析，并结合统计学和生物信息学分析方法建立微生物与功能物质的相关性研究，进一步探究酱香型白酒的呈香呈味机理，对于企业理论结合实际指导生产具有极其重要的意义。结合研究发现可在提取宏基因组的过程中加入EMA 或者PMA，以选择性地去除环境样品群落中死亡微生物的DNA，同时保留来自活细胞的完整DNA，达到高效提取高质量基因组的目的，保证定量分析的准确性。利用EMA 或者PMA 进行荧光定量PCR解析酱香型白酒发酵过程中大曲、酒醅、窖泥等机制中微生物组成结构，结合微生物的相互作用分析，对于研究酱香型白酒发酵机制和呈香机理具有十分重要的意义。