昆虫病原线虫共生菌NK杀虫蛋白处理后大蜡螟幼虫中肠细菌群落的变化

廖春丽，袁 源，李绍冲，王泓云，梁家琪，赵 静，杨 云，李冰冰

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.河南城建学院 河南省健康食品工程技术研究中心，河南 平顶山 467036；3.河南城建学院 河南省水体污染防治与修复重点实验室，河南 平顶山 467036)

昆虫体内的肠道微生物构成了昆虫肠道的微生态体系，它们在昆虫肠道内定殖,完成生长、代谢、增殖等全部生命活动。昆虫肠道定居着大量的微生物，其与宿主在长期协同进化过程中形成了紧密的互利共生关系[1-2]，影响着昆虫的生长和发育，参与昆虫的消化、营养吸收和繁殖，而且肠道细菌对信息素的产生、维生素的合成、杀虫剂的降解以及病菌的防御也有重要作用。鉴于昆虫肠道微生物的重要功能，相关研究已越来越受国内外学者重视。

大蜡螟(Galleria mellonella)是昆虫病原线虫重要寄主之一，人们常利用大蜡螟幼虫对昆虫病原线虫进行分离、诱集和对昆虫致病力进行测定[3]。可采用大蜡螟诱捕法分离韭菜土壤样品中的线虫，从异小杆属昆虫病原线虫肠道内分离到具有较高杀虫活性的肠杆菌株NK，通过其形态、生理和生化特征，并结合16S rDNA序列分析等手段将其鉴定为新属-肠杆菌属(Enterobacter)[4]。

近年来，已有一些关于Bt杀虫蛋白对昆虫肠道细菌影响的研究报道。Broderick等[5-6]从舞毒蛾Lymantria dispar中肠中发现Bt杀虫活性的发挥必须依赖于肠杆菌Enterobactersp.NAB3，并且还发现Bt活性与中肠微生物的关系因昆虫种类而异。张浩等[7]发现肠道菌在Bt杀虫过程中对棉铃虫起到保护作用。李振等[8]发现经Bt杀虫蛋白处理后二化螟幼虫中肠细菌群落的丰富度出现变化，推测可能与二化螟取食Bt杀虫蛋白有关。鉴于目前新属-NK菌株(日沟维肠杆菌)杀虫蛋白对大蜡螟肠道细菌群落的影响状况仍未清楚，因此研究取食NK菌株杀虫蛋白后大蜡螟幼虫肠道微生物的群落结构的变化，对于明确大蜡螟肠道细菌与NK菌株杀虫蛋白之间的关系具有重要的意义。

随着分子生物学的发展，基于核酸序列分析的现代分子生物学技术已广泛应用到昆虫的肠道微生物学研究中。细菌核糖体16S rDNA 基因可变区是此类生物物种的特征核酸序列，可用来进行细菌的分类鉴定。本文采用高通量测序技术手段对未饲喂蛋白和饲喂不同时间蛋白的大蜡螟幼虫中肠细菌的16S rDNA 基因 V3-V4 区的PCR产物采集4个样本，检测其群落多样性及群落结构的变化，探讨肠道细菌与昆虫病原线虫共生菌NK杀虫蛋白之间的关系，进而为阐明昆虫病原线虫共生菌NK杀虫机制提供一定的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 共生菌NK杀虫蛋白

从昆虫病原线虫共生菌NK胞内提取纯化杀虫蛋白(-80 ℃冷冻保存)。

1.1.2 供试昆虫

大蜡螟3龄幼虫(Galleria mellonella larvae)，于网上选购。将3龄的大蜡螟幼虫，每个平板分装15条，用含有0.2 mg/g浓度杀虫蛋白的饲料进行投喂，饲喂3个不同时间段(36 h、48 h和60 h)作为3个实验组，编号分别为BG1、BG2、BG3，每个实验组设置3个平行，同时用不含杀虫蛋白的饲料喂养大蜡螟幼虫作为空白对照组,编号为BG0。培养温度25～30 ℃，湿度75%，避光。

1.2 方法

1.2.1 肠道的解剖与保存

选取实验组和对照组大蜡螟幼虫120条。在无菌操作条件下解剖出中肠，将中肠放入2 mL离心管中，每管放入40条幼虫的中肠，每个处理3管。离心管中提前放入0.7% 的生理盐水500 μL，单管编号，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 DNA的提取和 PCR扩增

使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA，美国)试剂盒，参照说明书提取大蜡螟幼虫肠道总基因组，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提质量，检测合格后的样品进行PCR扩增。

PCR接头引物如表1所示，引物为Miseq测序平台中细菌16S rDNA，V3-V4区通用引物。

表1 PCR扩增时引物序列

PCR反应的扩增程序包含两轮。第一轮扩增：首先在94 ℃、 94 ℃、45 ℃、65 ℃温度下，依次进行 3 min、 30 s、20 s、30 s，共5个循环；然后在94 ℃、55℃、 72 ℃温度下，依次进行20 s、20 s、30 s，共20个循环；最后在72 ℃条件持续延伸5 min。第二轮扩增(引入Illumina桥式PCR兼容引物)：首先在94 ℃、94 ℃、55 ℃、72 ℃ 温度下，依次进行3 min、20 s、20 s、30 s，共5个循环，然后在72 ℃持续延伸5 min；最后将得到的PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，对其进行质量检测。浓度和特异性合格后送上海生工生物有限公司进行高通量测序。上样顺序依次为BG0、BG1、BG2和BG3。

1.2.3 大蜡螟幼虫中肠微生物基因组高通量测序及数据分析

采用Illumina Miseq 测序平台对1个对照组和3个实验组样品的16S rDNA V3-V4区PCR产物进行双端测序。利用RDP、Silva、NCBI 16S数据库对大蜡螟中肠细菌16S rDNA序列进行物种注释，群落分类。基于OUT的统计结果，利用Mothur软件计算Alpha多样性指数，包括反映样品中群落丰富度的Chao1指数和观测物种数(number of observed species)以及反映样品中物种多样性的Shannon 指数和 Simpson 指数。

2 结果与分析

2.1 大蜡螟肠道DNA的提取和PCR扩增

大蜡螟肠道DNA提取结果如图1所示，图1中4个不同处理组中1条带存在轻微的降解与断裂，不影响PCR扩增的结果，其他2、3、4条带明亮清晰，表明DNA含量丰富，符合PCR扩增所需的浓度要求。大蜡螟肠道DNA16S rDNA V3-V4区的PCR扩增产物见图2，经电泳检测均在600 bp左右出现明显的条带，与预期产物大小相符，且特异性良好，故直接用于高通量测序。

注：1、2、3、4分别代表BG0、BG1、BG2和BG3。

注：1、2、3、4分别代表BG0、BG1、BG2和BG3。

2.2 序列拼接组装信息

大蜡螟幼虫肠道细菌16S rDNA高通量测序基本信息见表2。

表2 大蜡螟幼虫肠道细菌16S rDNA高通量测序基本信息

由表2可知：大蜡螟幼虫中肠肠道细菌 4个样本(BG0、BG1、BG2和BG3)16S rRNA高通量测序共产生原始序列分别为71 722、67 559、65 549、63 200条；质控拼接后得到优质序列分别为70 350、67 559、64 370、61 725条；基于97%的相似水平，大蜡螟幼虫肠道细菌OTU聚类分析分别获得1 872、1 445、1 262和1 591个OTUs。基于OTUs的分类结果，大蜡螟幼虫肠道样本中细菌分属于14、15、9、11个门，27、27、20、22个纲，41、33、31、39个目，58、58、45、56个科，71、80、57、84个属。

2.3 大蜡螟肠道细菌的种类组成及其丰度

大蜡螟幼虫肠道样本在高通量测序的16S rDNA序列4个处理组注释：在门、纲、目和科分类阶元水平上的微生物群落组成如表3所示。在门分类阶元上，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)细菌为绝对优势菌。在纲分类阶元上，芽孢杆菌纲(Bacilli)和γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)细菌为绝对优势菌。在目分类阶元上，乳杆菌目(Lactobacillales)和肠杆菌目(Enterobacteriales)细菌为绝对优势菌。在科分类阶元上肠球菌科(Enterococcaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌为绝对优势菌。当然还有一些未注释成功的。

表3 大蜡螟幼虫肠道内在门、纲、目和科分类阶元上相对丰度(%)靠前的细菌

运用Blast软件对本次样本的物种分类进行分析，在4个样本属的水平上共注释到48个菌属，如图3所示。相对丰度靠前的细菌见表4。从图3和表4可知：厚壁菌门中的肠球菌属(Enterococcus)为优势菌，在4个处理组中所占比重分别为94.85%、48.02%、55.99%、48.94%；变形菌门中的肠杆菌属(Enterobacter)为优势菌，在4个处理组中所占比重分别为1.00%、40.39%、19.54%、36.22%，其次变形杆菌属、假单胞菌属和鞘脂单胞菌属等也占一定比重。

昆虫病原线虫共生菌NK胞内杀虫蛋白的侵入不仅影响了属的类别，而且改变了不同菌属间的数量。与对照组相比，实验组肠球菌属的数量明显降低，而实验组肠杆菌属、变形杆菌属、假单胞菌属的数量则明显上升。由图3和表4可知，昆虫病原线虫共生菌NK胞内杀虫蛋白对大蜡螟中肠微生物的肠球菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、假单胞菌属的数量影响最大。

基于OTU的样本聚类树图见图4。根据图4样本间的距离可以看出，树枝的长度代表样本间的距离，越相似的样本会越靠近，反之越远。实验组与对照组的样本群落相似度相差甚远，而3个处理组的样本群落相似性则较为接近，尤其是48 h和60 h处理组相似性最为接近，说明用昆虫病原线虫共生菌胞内杀虫蛋白饲喂大蜡螟会改变大蜡螟中肠微生物群落之间的相似性，并且饲喂时间越长，对照组和实验组大蜡螟中肠微生物群落之间的相似性相差越大。

图3 不同处理二化螟幼虫中肠细菌物种注释结果柱状图

表4 大蜡螟幼虫肠道内在属分类阶元上相对丰度(%)靠前的细菌

图4 基于OTU的样本聚类树图

2.4 大蜡螟肠道细菌Alpha分析

Alpha多样性指数评估可以反映样本内菌群的多样性。选取观测物种数、Chao1、Shannon、Simpson和Coverage 5个常用指数来分析大蜡螟肠道菌群的多样性，见表5。观测物种数和 Chao1(物种总数指数) 指数值越大，表示样品中群落丰富度越高；Shannon 指数越高，Simpson指数越小，说明样品中的物种多样性越高；Coverage表明样品序列的覆盖率，其值越大覆盖越完全。由表5可知，大蜡螟肠道中细菌种类均具有较高的丰富度和一定的多样性，并且样品序列的覆盖率也很高。

表5 大蜡螟幼虫肠道细菌多样性指数统计

图5 大蜡螟幼虫肠道细菌OTUs的Rank-abundance曲线

和对照组相比，实验组中随着饲喂杀虫蛋白时间越长，其Chao1指数越小，表明昆虫病原线虫杀虫蛋白的侵入降低大蜡螟中肠微生物的物种总数；其Shannon指数越大，Simpson指数越小，表明昆虫病原线虫杀虫蛋白的侵入增加大蜡螟中肠微生物的群落多样性。但在BG3(60 h)样本，物种总数又稍微升高，推测在60 h大蜡螟已经死亡，微生物大量繁殖的结果；Shannon指数稍微降低，Simpson指数稍微变大，推测在60 h大蜡螟已经死亡，起分解作用的微生物增加，降低群落多样性。

Rank-abundance 曲线可以同时展现4个样品中所含物种的丰富程度和均匀程度，见图5。由图5可知：大蜡螟肠道中的细菌组成丰富，因为物种的丰富程度由曲线的横轴长度来反映，4个样本曲线宽，说明它们的物种组成丰富；但大蜡螟肠道中的细菌均匀度不高，因为物种的均匀度由曲线形状来反映，4个样本曲线不平坦，说明它们的均匀度不高，即存在一些丰度占比较高的细菌种类。

3 结论与讨论

以往关于肠道微生物的研究主要采用离体平板培养和克隆文库法，且集中于细菌群落结构和多样性分析方面[9]。近年来，高通量测序技术为全面掌握肠道菌群结构提供了强有力的分析手段。通过Illumina Miseq测序技术检测细菌16S rDNA序列，可系统分析大蜡螟幼虫肠道内细菌的种类多样性和群落结构组成。

根据Alpha多样性指数评估样本内菌群的多样性，与对照组相比经昆虫病原线虫共生菌NK胞内蛋白饲喂的实验组，大蜡螟中肠细菌的物种总数减少，但实验组大蜡螟中肠微生物的群落多样性增加，与对照组的优势菌群肠球菌属等相比，实验组的优势菌群则为肠球菌属、肠杆菌属和变形杆菌属等。基于OTU的样本聚类树图和Rank-abundance 曲线可知：对照组和实验组，大蜡螟中肠微生物群落之间的相似性相差较大；大蜡螟肠道中的细菌组成丰富，但均匀度不高，即存在一些丰度占比较高的细菌种类。

与对照组相比，实验组肠球菌属所占比重明显下降，说明肠球菌属在大蜡螟幼虫受到NK杀虫蛋白的影响后导致该菌比重降低。通过用抗生素和不用抗生素处理的无菌昆虫验证了烟草天蛾 Manduca sexta 和小菜蛾的肠道内的肠球菌能部分降低 Cry1Ac 的杀虫活性[10]。舞毒蛾幼虫肠道内共生的肠球菌也能降低苏云金芽孢杆菌的杀虫活性[11]。由此推测NK杀虫蛋白能抑制肠球菌生存，同时肠球菌也能抑制NK杀虫蛋白活性，肠球菌属作为大蜡螟中肠微生物的绝对优势菌群(比重占94.85%)对昆虫生理可能起到有益的作用，只有通过降低肠球菌比重，NK杀虫蛋白才能最终发挥杀虫功能，从而影响大蜡螟幼虫的生理活动。

与对照组相比，实验组肠杆菌属比重明显增加，说明大蜡螟幼虫肠道内可能通过肠杆菌属比重的增加，来适应NK 杀虫蛋白的处理，也有可能这类菌更能耐受有NK杀虫蛋白的肠道环境。同时肠杆菌属中包含大量的沙门氏菌、志贺氏菌等条件致病菌，这些肠杆菌属中的一些细菌对大蜡螟可能起着有害的作用，它们和NK杀虫蛋白共同影响大蜡螟幼虫的生理活动。

与对照组相比，实验组新增了不动杆菌属、克吕沃尔氏菌属这两种新的菌属。不动杆菌属是导致肠道感染的重要病原菌之一[12]，克吕沃尔氏菌属是典型的条件致病菌属，可见这两种菌属也会对大蜡螟幼虫造成危害，它们也和NK杀虫蛋白共同影响大蜡螟幼虫的生理活动。

大蜡螟肠道微生物群落结构的变化可能与昆虫病原线虫共生菌NK胞内杀虫蛋白的介入有关，从而为阐明它的杀虫机制提供一定的借鉴和参考。但是大蜡螟中肠优势细菌群落变化是助推还是抑制杀虫蛋白引起大蜡螟幼虫的死亡？还需要进一步的探索。