基于GEO 数据挖掘与网络药理学探讨小陷胸汤缓解NSCLC 的分子靶点及作用机制

陆文鹏 陈 民 董小耘

肺癌常年居于我国恶性肿瘤发病率和病死率首位，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是其中最常见的类型，约占原发性肺癌的85%[1]。中医认为，肺癌病机属本虚标实，病位在肺，与肝、脾、肾关系密切[2]。小陷胸汤由黄连、半夏、瓜蒌组成，黄连苦寒，能泄热除痞，半夏辛温，可化痰散结，降逆水饮；三药合用可清热化痰散结，熊继柏教授曾应用小陷胸汤加减治疗肺癌肝火犯肺、痰热壅盛之证，并取得较好的疗效[3]。临床应用当把握其“痰热互结”的病机，运用异病同治，可缓解多种心胸、胁下、胃脘不适疾病[4]。研究表明，小陷胸汤抗肿瘤的作用主要机制有：抑制肿瘤细胞增殖、侵袭迁移，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬，阻滞肿瘤细胞周期，抑制肿瘤血管生成，调节免疫抑制肿瘤微环境等[5]。本研究通过网络药理学联合基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库，获取有关NSCLC 患者跟正常人肺组织细胞的芯片，分析两者中存在基因表达的差异，筛选小陷胸汤的主要活性成分，并探究其对NSCLC 的作用靶点及生物通路，以期进一步阐明小陷胸汤缓解NSCLC 的可能作用机制。

1 方 法

1.1 NSCLC 差异基因筛选 利用NCBI 子网站GEO数据库，以“non-small cell lung cancer”为检索词，通过筛选，下载其相关GSE、GPL 平台文件，使用R软件利用“packages”“pheatmap”及“Limma”包以lgFC＞1（FC 表示差异倍数）、矫正后P 值＜0.05 为条件筛选出差异表达基因，并导出文件，后利用ggplot2包绘制差异基因火山图；pheatmap 包绘制差异基因的热图。

1.2 小陷胸汤药物成分及靶点筛选 以OB≥30%，DL≥0.18 为有效活性成分筛选条件，在TCMSP 数据库筛选，获取黄连、半夏、瓜蒌3 味中药有效成分。结合TCMSP 中Relate Targets 的文件得到有效成分对应的靶点，再通过uniprot 注释文件，将靶点转化为基因ID。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及作用靶点网络构建将1.1 中的NSCLC 靶点与1.2 中小陷胸汤潜在药物靶点绘制韦恩图，得到小陷胸汤与NSCLC 的共同靶点，将其导入Cytoscape3.8.2，同时将上述“1.2”获得的活性成分及靶点关系导入以完成相关网络构建。

1.4 蛋白互作与拓扑网络图构建 将共同靶点导入STRING 数据库，获取PPI 网络。再利用Cytoscape 3.8.2 软件对PPI 信息进行网络可视化，并对PPI 网络进行分析，筛选出核心靶点。

1.5 靶点通路分析 利用Bioconductor 平台将靶点基因ID 转化为entrez ID。通过R 软中相关Bioconductor 安装包，设置P=0.05、Q=0.05 进行GO 富集分析，保存富集结果并选取生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）各自前10 位绘图。同样方法进行KEGG 分析，再利用Cytoscape3.8.2 软件进行KEGG 关系网络的构建。

1.6 分子对接验证 从PDB 数据库中筛选得到的关键靶蛋白的3D 结构“.pdb”格式文件，在PubChem中得到小陷胸汤中对应关键靶点蛋白的化合物的2D 结构，并导入Chem3D 软件得到优化后的3D 结构；通过SYBYL-X 2.0 软件对靶点蛋白去水、加氢、计算电荷等处理，再导入化合物3D 结构，使用Surflex-Dock 模块对药物小分子和靶蛋白受体进行分子对接分析。根据Total-Score 打分函数对活性成分与靶标蛋白相互作用进行评分，Total-Score 值愈大，说明小分子化合物与大分子蛋白的匹配结合作用越好。以Total-Score＞5 为阈值，进行绘图。

2 结果

2.1 肺癌疾病靶点筛选结果 在GEO 数据库中获取GSE1987 数据集，所采用的平台为GPL91，共有9例正常人样本及28 例NSCLC 患者样本。共筛选出差异表达基因520 个，其中上调基因200 个、下调基因320 个。热图（见图1）中横坐标是样本名称（正常对照组在前，肿瘤组在后），纵坐标为基因名称。表达程度由低到高用绿色、黑色、红色标注。如差异基因MMP1 在肿瘤组高表达，在正常对照组为低表达。火山图（见图2）中，横坐标中logFC＞1 时，表示在肿瘤组上调；logFC＜-1 时，表示在肿瘤组下调。

图1 正常对照组与非小细胞肿瘤患者差异基因热图

图2 正常对照组与非小细胞肿瘤患者差异基因火山图注：黑色为在正常对照组与肿瘤组无差异基因；绿色为在正常对照组上调，在肿瘤组下调；红色为在正常对照组下调，在肿瘤组上调

2.2 药物成分及靶点筛选结果 使用TCMSP 数据库搜索药物的成分，筛选后得到有效成分：黄连14个，半夏13 个，瓜蒌11 个，见表1。结合Relate Targets 文件得到184 个靶点基因。

表1 药物成分及靶点筛选结果

2.3 小陷胸汤缓解NSCLC 活性成分与作用靶点网络图 将小陷胸汤与NSCLC 差异基因取交集后，得到交集Venn 图（见图3）及交集数据，将数据导入Cytoscape3.8.2，绘制分子基因网络图（见图4）。共得到潜在基因靶点20 个，对应的有效成分19 个。其中对应靶点较多的是黄连的活性成分槲皮素（对应16个靶点），其次是半夏的活性成分松柏苷和卡维丁（各对应4 个靶点）；对应活性成分较多的靶点ADRB2（对应10 个活性成分）、NR3C2 和F10（分别对应7 个活性成分）可能为小陷胸汤缓解NSCLC的关键靶点。

图3 小陷胸汤与非小细胞肺癌Venn 图

图4 小陷胸汤对非小细胞肺癌作用靶点网络图

2.4 小陷胸汤缓解NSCLC 基因的蛋白互作网络与拓扑网络图 将上一步所得20 个共同靶点导入String 数据库，设置置信度为Highest≥0.9，并剔除独立于网络以外的靶点，获取PPI 相关信息，可得到PPI 图（见图5），利用Cytoscape3.8.2 软件对PPI 信息进行网络可视化，并对PPI 网络进行ClosenessDegree、Betweenness、Eigenvector 算法拓扑分析找出每个条件大于中位值的基因，并进行可视化（见图6）。拓扑网络图中，有20 个节点，202 条边，其中黄色基因位于网络的核心位置为关键基因，其算法拓扑分析中个数值均大于中位数，在蛋白互作网络中发挥着关键调控作用。

图5 小陷胸汤缓解非小细胞肺癌基因的PPI 图

图6 小陷胸汤缓解非小细胞肺癌基因的蛋白拓扑网络图

2.5 靶点通路分析 使用R 软件对小陷胸汤治疗胃癌的基因进行GO 富集分析（见图7）。靶点显著富集于对类固醇、多细胞生物过程、对金属离子的反应等生物过程；内质网、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等细胞组成；丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸型水解酶活性等分子功能。

图7 GO 富集分析气泡图

使用R 软件，进行KEGG 富集分析，共富集到11 条通路关系（见图8）。将KEGG 的11 条通路导入Cytoscape3.8.2。根据degree 值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制通路基因网络图（见图9）。其中液体剪切应力和动脉粥样硬化（5 个靶点、13.5%）、晚期糖基化产物-晚期糖基化终末产物受体（AGERAGE）信号通路（4 个靶点10.8%）、脂质和动脉粥样硬化（4 个靶点10.8%）、细胞衰老（4 个靶点10.8%）、p53 信号通路（3 个靶点8.1%）、IL-17 信号通路（3 个靶点8.1%）、孕酮介导的卵母细胞成熟（3 个靶点8.1%）、肿瘤坏死因子信号通路（3 个靶点8.1%）、细胞周期（3 个靶点8.1%）、松弛素信号通路（3 个靶点8.1%）、膀胱癌（2 个靶点5.4%）等，对应的MMP9、CCL2、CDK1、CCNB1、MMP1、SELE 基因数目较多。

2.8 分子对接结果 将核心靶点CCL2、CAV1、IGFBP3、MMP9、SPP1、MMP1 与其对应的化合物进行分子对接分析，其中CAV1、IGFBP3 在uniprot 中未找到合适的蛋白结构。经过计算Total-Score＞5 的有槲皮素与靶点MMP1（1HFC）以及槲皮素与靶点SPP1（3CXD）。见图10。

图10 槲皮素与MMP1（1HFC）及SPP1（3CXD）分子对接模型

3 讨论

NSCLC 发病隐匿，胸部CT 作为早期筛查方案在我国常规体检中并未完全普及，导致约有70%的NSCLC 患者确诊时已是晚期[6]。目前治疗多采用靶向治疗、免疫治疗和含铂类双药化疗等全身治疗为主的综合治疗模式[7]，但这些药物的使用对患者身体状况要求较高。而中医多作为辅助疗法，能减轻西药的不良反应、增加治疗效果、延缓病情进展，以延长患者的生存时间，改善患者生活质量[8]。

本研究共筛选出小陷胸汤有效成分38 个，其中作用最显著的是槲皮素，其余成分还有松柏苷、卡维丁、β-谷甾醇、小檗碱等。槲皮素为黄酮类化合物，其有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[9]。槲皮素可抑制肺癌细胞增殖生长和侵袭转移、促进肺癌细胞凋亡、增加各项治疗的敏感性，对肺癌裸鼠动物移植瘤也有明显的抑制作用[10]。槲皮素能够增强LAP3 基因沉默抗NSCLSC 中A549 细胞增殖、侵袭和迁移的作用，抑制细胞上皮间质转化进程[11]。松柏苷抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与其有抗炎[12]、抗氧化[13]的作用相关。卡维丁能明显抑制内毒素诱导的腹腔巨噬细胞TNF-α、白细胞介素-6（IL-6）和NO 生成[14]，这是否是其抗肿瘤的机制可进一步研究。β-谷甾醇可诱导肺癌细胞凋亡性死亡[15]。小檗碱可通过调控Hedgehog 信号通路抑制肺癌干细胞增殖，促进其凋亡[16]。小檗碱在NSCLSC 化疗中能协同降低p-STAT3 及其下游信号分子HIF-1α 和cyclin D1 的表达以增加化疗敏感性[17]。氧化小檗碱通过下调Src-FAK-Ras-Raf-MEK-ERK 通路抑制肺癌细胞的增殖，从而达到抗NSCLC 的作用[18]。

根据拓扑网络图，MMP9、CAV1、MMP1、SPP1、CCL2、IGFBP3 可能是小陷胸汤缓解NSCLC 的关键作用靶点。MMP9 可作为NSCLC 诊断的潜在生物标志物[19]，其与肿瘤细胞的侵袭性有关[20]。CCL2 能增强炎症单核细胞和中性粒细胞等特定细胞类型的抗肿瘤能力[21]。IGFBP3 是胰岛素生长调控结合蛋白，其能阻断癌细胞膜上糖蛋白配体，从而避免癌细胞内第二信使激活，癌细胞增殖活性降低，升高IGFBP3 蛋白水平，能够增加NSCLC 一线化疗方案的敏感性[22]。根据GEO 数据库所得NSCLC 基因热图，可见MMP1、SPP1 为NSCLC 高表达蛋白。

GO 富集分析显示，小陷胸汤可通过多个靶点来缓解NSCLC。根据KEGG 通路分析，小陷胸汤治疗NSCLC 主要涉及11 条通路，主要通路为糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、p53 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、松弛素信号通路等。AGERAGE 信号通路与炎症反应有关，该通路可以调节炎症增殖阶段发展[23]，有学者在探索薤白治疗肺癌过程中发现AGE-RAGE 信号通路是治疗肺癌的重要通路之一，并绘制了AGE-RAGE 信号通路图[24]。p53是目前较明确的与肿瘤密切相关的抑癌基因，有研究表明肺癌与p53 表达水平有一定相关性[25]。抑制p53 信号通路可以抑制A549 细胞增殖、侵袭转移，诱导A549 细胞凋亡从而缓解NSCLS[26]。此外有研究表明，抑制通过该通路诱导的细胞凋亡途径，对损伤的心肌、神经元有一定保护作用[27-28]，这些在肺癌的治疗过程中能缓解他脏并发症。IL-17 高表达是肺癌患者无病生存的危险因素[29]，抑制IL-17 信号通路持续活化能有效调节肿瘤迁徙微环境，起到缓解肺癌的作用[30]。TNF 通路与多种免疫性疾病相关，TNF 是一种促炎因子，其在体内外对多种肿瘤均有明显的抑制和杀伤作用[31]，TNF-α 可作为肺癌诊断的生物标志物之一[32]。肺癌治疗中，激活TNF-α 通路可促进A549 细胞增殖和迁移能力[33]。松弛素为内源性肺保护因子，可减轻肺纤维化，抑制气道重塑[34]。

综上所述，本研究为小陷胸汤中有效成分，通过联合GEO 差异分析及网络药理学初步探究了小陷胸汤在NSCLC 治疗中的作用机制，为小陷胸汤缓解NSCLC 提供了新的参考依据，但本研究仍存在一定局限性，相关作用靶点及通路仍需进一步验证。