藏绵羊PRDX5基因的克隆及其在睾丸中的表达

陈娜娜，安雪姣，满永恒，李讨讨，王 霞，马友记

（1. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 甘肃 兰州 730070；2. 甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室, 甘肃 兰州 730070；3. 永昌县肉用种羊繁育技术推广站, 甘肃 金昌 737200）

过氧化物酶(peroxidases of the peroxiredoxin, Prx)最初在酵母中被发现，是分子大小为20～30 kDa的过氧化物酶家族，该家族的基本生物学功能是防止细胞氧化损伤[1]。而过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,PRDX)家族是在原核生物和真核生物中广泛分布的抗氧化剂酶家族[2]，在恶行肿瘤[3]、器官衰老[4]、神经性疾病[5]、癌症[6]等生物学过程中发挥作用。其家族中的过氧化物氧化还原酶5 (peroxiredoxin 5,PRDX5)是一种分子大小17 kDa的硫氧还蛋白过氧化物酶，也被称为PrxV、ACR1、PMP20或AOEB166，在甲状腺、气管、肾脏、肺、肾上腺、心脏等多个组织中高表达[7-8]。PRDX5在哺乳动物中除了在细胞增殖中发挥作用，还可以中和动物生命活动过程中产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)来阻止氧化剂毒性对细胞的损伤[9-10]。

藏绵羊(Ovis aries)原产于青藏高原，是世界上最常见、分布最广的驯养动物。因其长期生活在低氧高海拔环境，使其形成了抗严寒、耐粗饲、适应高海拔，但性成熟晚的特点。睾丸是雄性动物精子发生、发育和成熟的重要场所，在精子发生过程中会产生ROS[11]。ROS是细胞新陈代谢的产物之一，发生在所有有氧生物机体中，作为含氧分子的高反应性基团，ROS包括自由基，例如超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(-OH)，以及非自由基分子，例如过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O2)等[12]。适当水平的ROS是维持精子发生正常进行的一个关键因素[13]，但是研究发现在低压缺氧条件下，精子发生过程中因受到氧化应激影响会产生过量的ROS，使睾丸组织受损，精子发生受阻，影响精液品质并诱导DNA损伤和凋亡[14-15]。而PRDX5可以还原细胞产生的过量ROS，保证精子活力并维持ROS的稳态，而且有研究证明PRDX5在细胞中过表达可以保护细胞免受氧化应激威胁[16]，抑制细胞中PRDX5表达会诱导细胞氧化应激，ROS水平升高，从而导致细胞死亡[17-18]。因此PRDX5基因表达水平的高低可能与精子发生状态和睾丸细胞发育相关。目前，关于PRDX5的研究主要集中在人[19-20]、大小鼠[21]、犏牛和牦牛[22]上，藏绵羊上鲜有报道，故本研究通过对PRDX5在性成熟前后的藏绵羊睾丸组织中的表达情况和分布模式进行研究，初步探究PRDX5在藏绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用，为提高藏绵羊繁殖力提供参考依据。

1 材料及试剂

选择性成熟前(3月龄)、性成熟期(1周岁)和成年(3周岁)的健康雄性藏绵羊各8 只(甘肃省夏河藏羊养殖合作社提供)，屠宰后采集每只藏绵羊的睾丸组织。

本试验所用试剂中的Trans Zol UP RNA提取试剂盒和2 × Fast qPCR Master Mixture试剂盒采购于全式金生物技术有限公司(北京)，Evo M-MLV 反转录试剂盒采购于艾科瑞生物科技有限公司(湖南)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒采购于天根生化科技有限公司(北京)，高效RIPA裂解液和6 × SDS (sodium dodecyl sulfate, SDS)上样缓冲液采购于索莱宝科技有限公司(北京)，PRDX5和β-actin的兔源一抗、山羊抗兔二抗、免疫组织化学染色试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒采购于博奥森生物技术有限公司(北京)。

2 试验方法

2.1 总RNA提取及cDNA合成

将采集的藏绵羊睾丸组织根据Trans Zol UP RNA提取试剂盒的操作方法提取各阶段的RNA各20 uL。琼脂糖检测合格后利用Evo M-MLV 反转录试剂盒反转录成cDNA，-20 ℃保存备用。

2.2 引物设计与合成

根据NCBI提供的绵羊PRDX5和β-actin的mRNA序列利用Primer Premier 6.0软件设计引物后送至中科羽瞳生物科技有限公司合成(表1)。

2.3 藏绵羊PRDX5基因克隆

以藏绵羊睾丸组织cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物(10 mmol·L-1) (表1)各0.5 μL，高保真DNA聚合酶(1 U·m-1) 10 μL，用ddH2O补至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃2 min，32个循环；72 ℃ 2 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后获得659 bp大小的片段，根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明对目的片段纯化并回收，连接转化，培养后随机挑选4个单菌株鉴定后送至中科羽瞳生物科技有限公司进行测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.4 qRT-PCR及PRDX5 mRNA的相对表达量

根据2 × Fast qPCR Master Mixture试剂盒的操作说明进行qRT-PCR扩增。使用2-ΔΔCt方法对qRT-PCR中所得到的Ct值进行结果计算，得出不同阶段睾丸组织中PRDX5的mRNA相对表达量。

2.5 Western blot及PRDX5蛋白相对表达量

使用高效RIPA裂解液提取各阶段藏绵羊睾丸组织蛋白后与6 × SDS上样缓冲液按5 : 1混匀后在100 ℃金属浴中加热10 min使其充分变性。放置室温后将蛋白样品加入12% SDS-PAGE，40 V电泳6 h后恒压100 V湿转45 min，取出聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)，用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液室温封闭2 h，然后加入PRDX5 (1 :700)和β-actin (1 : 1 500)的兔源一抗，置于4 ℃冰箱孵育12 h。第2天把PVDF膜用PBST洗涤(3次，每20 min一次)后加入山羊抗兔二抗(1 : 5 000)，常温孵育2 h。PBST洗涤(4次，每次15 min)后进行化学曝光。Western blot条带灰度值由AlphaEaseFC 6.0图像分析软件扫描测定后计算PRDX5蛋白的相对表达量。

2.6 免疫组织化学染色

将制备好的石蜡切片置于60 ℃烘箱中4 h，然后依次进行脱蜡、脱水、抗原修复处理。将切片放置10 mim后按照免疫组织化学染色试剂盒的说明书进行操作，其中一抗PRDX5稀释比例为1 : 150，阴性对照用PBS代替一抗。切片用PBS清洗(3次，每7 min一次)后用DAB显色试剂盒显色，自来水终止，苏木素复染，1% HCl-酒精分化，梯度浓度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。待切片自然风干后使用Olympus Dp71生物显微镜(日本)观察并拍照。

2.7 系统进化树构建和克隆序列分析

使用DNAMAN 6.0软件对克隆得到的序列与其他物种进行氨基酸序列比对。利用MEGA7.0软件中的邻位相连法(neighbor-joining method, NJ Method)构建系统进化树。利用ProtPara、Signal-4.0、SOPMA和phyre2在线软件对PRDX5基本理化性质、信号肽、蛋白二级和三级结构进行预测分析。

3 结果与分析

3.1 藏绵羊PRDX5基因CDS序列特征

本研究获得大小为659 bp的目的片段(图1)。BLAST比对后发现藏绵羊PRDX5的氨基酸序列与NCBI中提供的绵羊序列(XM_004019653.4)完全一致；氨基酸序列同源性比对结果显示，藏绵羊PRDX5序列与山羊(Capra hircus)、普通牛(Bos taurus)、马(Equus caballus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、猪(Susscrofa)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的序列相似度分别为99.09%、94.52%、79.45%、74.89%、66.21%、55.71%和55.25%(图2)；蛋白空间结构由α-螺旋(33.33%)、延伸链(22.37%)、β-转角(8.68%)和无规则卷曲(35.62%)组成(图3和图4)；理化性质预测发现，PRDX5蛋白的分子式为C1039H1671N285O297S8，分子量为23 163.91 kD，理论等电点为8.62，不稳定系数为33.06，属于稳定蛋白且无信号肽(图5)。系统进化树显示藏绵羊与山羊亲缘关系最近(图6)；总平均亲水性为0.185，脂肪系数为97.49，正负电荷残基数分别为22和25。

图1 藏绵羊PRDX5基因目的片段检测图谱Figure 1 Detection map of the target fragment of Tibetan sheep PRDX5 gene

图2 PRDX5氨基酸序列比(对同源性 ＞ 50%)Figure 2 PRDX5 amino acid sequence ratio (Homology ＞ 50%)

图3 藏绵羊PRDX5蛋白二级结构组成Figure 3 The secondary structure of Tibetan sheep PRDX5 protein

图4 藏绵羊PRDX5蛋白三级结构预测Figure 4 Prediction of tertiary structure of Tibetan sheep PRDX5 protein

图5 藏绵羊PRDX5蛋白信号肽预测Figure 5 Prediction of the signal peptide of Tibetan sheep PRDX5 protein

图6 藏绵羊PRDX5基因系统进化树构建Figure 6 Construction of a phylogenetic tree of Tibetan sheep PRDX5 gene

3.2 PRDX5 mRNA在睾丸组织中的表达

qRT-PCR方法结果(图7)显示，1周岁(性成熟期)和3周岁(成年)藏绵羊睾丸组织中PRDX5mRNA的相对表达量极显著高于3月龄(性成熟前) (P＜0.01)，并在性成熟后趋于稳定。

图7 藏绵羊睾丸中PRDX5 mRNA的表达Figure 7 Expression of PRDX5 mRNA in Tibetan sheep testis

3.3 PRDX5蛋白在睾丸组织中的表达

Western blot方法结果(图8)显示，1周岁(性成熟期)和3周岁(成年)藏绵羊睾丸中PRDX5蛋白表达量极显著低于3月龄(性成熟前) (P＜ 0.01)，并在性成熟后趋于稳定。

图8 藏绵羊睾丸中PRDX5蛋白的表达Figure 8 Expression of PRDX5 Protein in Tibetan sheep testis

3.4 PRDX5蛋白在睾丸组织中的定位

免疫组织化学染色方法结果(图9)显示，PRDX5蛋白定位在不同发育阶段的睾丸支持细胞和间质细胞，且在支持细胞连接处也有分布。

图9 藏绵羊睾丸组织中PRDX5蛋白分布Figure 9 Distribution of PRDX5 protein in Tibetan sheep testis

4 讨论与结论

本研究克隆得到的藏绵羊PRDX5基因的CDS区长659 bp，可编码219个氨基酸，这与NCBI中提供的绵羊序列(XM_004019653.4)完全一致，说明PRDX5基因可能在整个进化过程中高度保守。qRTPCR和Western blot结果显示，PRDX5从性成熟前到性成熟期其表达量在mRNA水平上呈增长趋势并在性成熟后趋于稳定，而蛋白水平正好相反，其原因可能与基因转录和翻译过程中受到多个层面的调控有关[23]。PRDX5蛋白在性成熟前的藏绵羊睾丸组织中表达量较高，PRDX5作为一种重要的过氧化物酶，具有抗氧化剂和抗凋亡功能[24]，PRDX5在细胞内高表达会抑制ROS的生成和积累[25]，使细胞免受氧化应激，且低水平的ROS在多种生物学过程中充当分子信使的角色[26]，有利于细胞发挥功能。随着藏绵羊的生长其睾丸中PRDX5的水平逐渐降低，可能导致ROS的水平逐渐升高，高水平的ROS可能使睾丸组织氧化受损，发育减慢，性成熟较其他品种晚。

免疫组织化学染色结果显示PRDX5基因在藏绵羊不同发育阶段睾丸支持细胞和间质细胞中都有分布，睾丸支持细胞在精子发生过程中起核心作用，其与生殖细胞之间构成的血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)是精子发生顺利进行的保障。除此之外，支持细胞还参与排精过程[27]。睾丸间质细胞在雄性生殖发育过程至关重要，其主要作用是合成和分泌睾酮，睾酮是在雄性动物青春期第二性征发育和成年期精子发生方面发挥关键作用的一种类固醇激素[28-29]。性成熟前因PRDX5的调节，低含量的ROS有利于BTB的结构完整，使精子发生微环境处于稳定状态，并保证间质细胞顺利合成并分泌睾酮。性成熟后，藏绵羊睾丸组织中PRDX5蛋白表达量降低，可能导致细胞中ROS含量升高，过量的ROS与DNA、蛋白质和脂质反应导致细胞内氧化-抗氧化系统失衡，使细胞处于氧化应激状态[30]。氧化应激是指氧化剂或活性物质活性氧[31]及抗氧化剂作用失衡的一种状态，倾向氧化状态，一般情况下会对机体产生负面作用[32]，它被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。支持细胞氧化损伤会导致生精细胞凋亡，曲细精管结构改变，精子运动能力减弱[33-34]，从而导致精子发生异常和排精困难。间质细胞氧化损伤后引起线粒体功能损伤及睾酮合成障碍[35]，影响藏绵羊精子发生和睾丸功能。藏绵羊长期生活在低氧高海拔地区，紫外线等外源性诱导因素也会促进睾丸细胞产生过量线粒体ROS，对精子发生过程产生不利影响[36-37]。PRDX5蛋白表达从性成熟期开始降低，细胞更容易受到氧化损伤和细胞凋亡。在氧化应激诱导下，精子DNA受损，受精能力减弱[36,38]，这可能也是影响藏绵羊繁殖力的潜在因素之一。以上结果显示性成熟后藏绵羊睾丸组织中PRDX5蛋白表达量降低可能导致藏绵羊睾丸组织氧化受损，细胞凋亡加速，抑制精子发生和成熟，对藏绵羊繁殖造成不利影响。但PRDX5在精子抗氧化防御机制中对ROS水平的具体调控机制有待进一步研究。