分子标记结合表型鉴定选育兼抗赤霉病、白粉病和条锈病弱筋小麦新品种扬麦38

赵仁慧，陈甜甜，王 玲，朱冬梅，汪尊杰，张 勇，张伯桥，高德荣，吴宏亚，别同德

(农业部长江中下游小麦生物学与遗传育种重点实验室/江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州 225007)

小麦赤霉病、白粉病和条锈病是长江中下游麦区主要病害。由于气候变暖、雨水增多、播期推迟等影响，小麦赤霉病和白粉病重发年份增加，条锈病在长江中游地区常年较重，而化学防治易带来农药残留、环境污染等问题。随着中国对农作物生产减肥减药的要求，生产上对绿色抗病小麦品种的需求日益迫切，选育多抗小麦品种是防治赤霉病、白粉病和条锈病最经济、环保的途径。

农业部2003年发布的《优质专用小麦优势区域发展规划》明确了长江中下游麦区为中国唯一的弱筋小麦优势产业带。弱筋小麦是饼干、糕点和酿酒等的重要原料。当前，以扬麦13、扬麦15、宁麦13等为代表的弱筋小麦品种仍存在综合抗病性较弱，难以满足弱筋小麦产业绿色有机化的发展趋势。

小麦-簇毛麦T6VS/6AL易位系92R137是中国重要的抗白粉病、条锈病资源，其簇毛麦6VS染色体上携带抗白粉病基因，是目前报道的抗性最强、抗谱最广的抗白粉病基因。据不完全统计，利用该易位系育成的抗白粉病小麦品种约有40个，主要集中在西南麦区和长江中下游麦区。由于、等早期利用的抗白粉病基因在长江中下游麦区不同程度地丧失抗性，已成为当前该麦区白粉病抗性育种的重要基因资源。易位系92R137的1B染色体上携带高抗条锈病基因(=)，该基因在西北春麦区、西南麦区应用极为广泛，但由于毒性菌株V26的出现，导致已基本丧失抗性。幸运的是，V26不是当前长江中下游麦区条锈菌的优势菌株，育成品种仍能满足该麦区生产上对条锈病抗性的需求。

籽粒硬度是弱筋小麦最重要的指标之一，在遗传上主要由和基因控制，任一基因突变都导致胚乳质地变硬。一般而言，中筋和强筋小麦均为硬质麦，而弱筋小麦为软质麦。王化敦等研究发现，扬麦系列品种均为野生型，软质麦与硬质麦的差异主要由基因变异造成，硬质麦如扬麦158、扬麦16等均为突变型，弱筋小麦如扬麦13、扬麦15等均为野生型。

扬麦16是江苏里下河地区农业科学研究所育成的高产中筋小麦品种，继承了扬麦158高产、适应性广(广适)和赤霉病抗性好(中抗)的优点，是过去10年间长江中下游麦区种植面积最大的中筋小麦品种，曾连续8年被列入农业部主导品种。为发挥扬麦16高产、广适的优势，同时利用易位系92R137的软质小麦特性及优异抗病性，本研究2007年以扬麦16为轮回亲本，92R137为供体亲本，构建了BC群体，低世代借助分子标记对抗白粉病基因、抗条锈病基因和硬度基因进行辅助选择，高世代结合赤霉病圃抗性评价及弱筋品质进行筛选，最终育成兼抗赤霉病、白粉病和条锈病的弱筋小麦新品种扬麦38。本文对其选育过程进行了总结，以期为小麦高产优质多抗新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

扬麦16是由江苏里下河地区农业科学研究所育成的高产、广适中筋小麦新品种，中抗赤霉病，中感白粉病和条锈病。

92R137是由南京农业大学陈佩度教授育成的小麦-簇毛麦T6VS/6AL易位系，其簇毛麦6VS染色体上携带抗白粉病基因，小麦1B染色体上携带抗条锈病基因，高抗白粉病和条锈病，高感赤霉病。

1.2 研究方法

1.2.1 杂交选育

于2007年秋季，在温室内以扬麦16为受体亲本、92R137为供体亲本进行杂交，2008年2月收获F代种子并种植于温室大棚，开花后与扬麦16回交，5月底收获BCF种子，当年6月在云南昆明种植BCF群体进行加代，10月底分单株收获BCF种子，当年11月按株行种植BCF群体于扬州湾头试验基地选种圃，2009年春季选择农艺性状表现优异的株行并结合分子标记鉴定筛选、和均纯合的阳性单株，于当年秋季种植在株行圃。2010-2013连续四年在优异株行选株并结合标记进行鉴定，直至农艺性状纯合，2013年夏收获BCF部分优异株系，经品质评价后，推荐其中弱筋株系进入产量鉴定圃，次年筛选弱筋品质优异且保持白粉病和条锈病抗性的小区系，同时根据赤霉病、白粉病病圃鉴定和条锈病异地鉴定等结果，筛选出兼抗赤霉病、白粉病和条锈病的弱筋小麦新品系。

1.2.2 分子标记鉴定

采用基于启动子序列开发的共显性功能标记MBH1检测抗白粉病基因；采用Wang等开发的共显性标记WE173检测抗条锈病基因；采用与籽粒高硬度相关的突变基因的STS标记检测硬度基因。标记引物序列见表1，由上海捷瑞生物有限公司合成。

小麦叶片基因组DNA的提取采用Sharp等的方法。PCR反应体系为10 μL，包括10 ng模板DNA，上、下游引物(10 μmol·L)各0.2 μL，200 μmol·L的dNTPs溶液0.8 μL，1 mmol·L的MgCl溶液0.8 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL，TaKaRa公司，日本)1 U， 10×聚合酶专用Buffer 1 μL，用ddHO补足至10 μL。PCR程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环； 72 ℃延伸10 min。采用8%(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶分离，AgNO溶液显色检测PCR产物。

表1 目标抗病基因检测标记引物序列Table 1 Primer sequences of molecular markers associated with target resistance genes

1.2.3 抗病性鉴定

赤霉病抗性鉴定采用单花滴注法，于2019-2020和2020-2021两年度在江苏里下河地区农业科学研究所试验基地赤霉病抗性鉴定圃进行。病原菌采用强致病力的赤霉菌混合菌株(F0301、F0609和F0980)，由江苏省农业科学院陈怀谷研究员提供。每个品系各取20个同日开花的麦穗，在顶部第5小穗注入10 μL分生孢子悬浮液(5×10个·mL)，日间弥雾保湿(每半小时弥雾5 min)，接种后21 d调查发病小穗数，计算病小穗率。病小穗率=(病小穗数/总小穗数)×100%。以高抗品种苏麦3号、高感品种安农8455和轮回亲本扬麦16作为对照。

白粉病抗性鉴定于2016-2017年度在江苏里下河地区农业科学研究所试验基地玻璃温室内进行，采用江苏里下河地区流行的白粉菌混合菌种进行人工接种。分别以含有的育成品种扬麦18和高感白粉病品种扬麦9号为抗、感白粉病对照品种。待扬麦9号充分发病时，调查群体发病情况，叶片出现分生孢子堆的材料表现为感病(S)，无分生孢子堆的材料表现为抗病(R)。

条锈病鉴定采用自然发病鉴定法，于2016-2017年度在湖北荆州适应性试验点进行，于2017年5月上、中旬条锈病充分发病时调查病级。根据国家行业标准(NY/T 1443.1-2007)中抗条锈病评价技术规范将反应型分为0～4级：“0”为免疫(IM)，不表现症状；“0；”为近免疫(NIM)，产生枯死斑点或失绿反应，但不产生夏孢子堆；“1”为抗病(R)，夏孢子堆很小且很少，周围有枯死反应；“2”为中抗(MR)，夏孢子堆小到中等，周围有枯死和失绿反应；“3”为中感(MS)，夏孢子堆大而多，周围组织无枯死反应，但有轻微失绿现象；“4”为感病(S)，夏孢子堆大而多，周围组织无枯死反应，失绿现象不明显。

1.2.4 产量及品质鉴定

于2016-2017和2017-2018两年度，参加长江中下游国家品种比较试验；于2018-2019和2019-2020两年度，参加国家区域试验，并调查有效穗数、穗粒数和千粒重；于2019-2020年度，同时参加国家生产试验。

小麦籽粒硬度、粗蛋白含量、湿面筋含量、面团稳定时间、SDS沉淀值、吸水率、拉伸阻力、拉伸面积等关键品质指标由农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)和国家小麦改良中心扬州分中心共同完成，检测参考张 晓等的研究方法。

2 结果与分析

2.1 抗白粉病基因 Pm21、抗条锈病基因 Yr26和软质基因 Pinb-D1a的分子标记检测结果

利用基因共显性功能标记MBH1对其亲本及BCF群体进行分子标记检测，筛选目标基因纯合单株。结果显示，基因纯合单株表现出与供体亲本92R137大小一致的条带，阴性单株具有与轮回亲本扬麦16大小一致的条带，基因杂合单株表现出双亲的组合条带(图1A)。

利用与基因紧密连锁的共显性标记WE173对BCF群体进行分子标记检测。结果显示，基因纯合单株具有与供体亲本92R137大小一致的条带，阴性单株具有与轮回亲本扬麦16大小一致的条带，基因杂合单株表现出双亲的组合条带(图1B)。

利用硬度突变基因显性功能标记Pinb-D1b对BCF群体进行基因鉴定，凡是出现基因特征条带的均为硬质麦，不具有该条带的说明含有基因，为软质麦(图1C)。

综合、和基因的标记检测结果，筛选携带、纯合(阳性)且软质基因型纯合(阴性)的聚合单株，剔除株高过高、穗子过小、分蘖过少等农艺性状较差的单株。将聚合单株播种成株行，逐代筛选优异株行并结合分子标记验证，直至农艺性状纯合，育成新品种14-214，于2022年通过国家农作物品种审定委员会审定，命名为扬麦38。

M：DL2000；A：利用标记MBH1的检测结果；B：利用标记WE173的检测结果；C：利用标记Pinb-D1b的检测结果。M：DL2000；1：扬麦16；2：92R137；3～20：部分BC1F2单株。

2.2 抗病性鉴定结果

对育成品种扬麦38分别进行白粉病、条锈病和赤霉病的抗性鉴定。白粉病抗性鉴定结果表明，扬麦38对白粉病表现为抗病，而轮回亲本扬麦16表现为感病(图2A)。条锈病抗性鉴定结果表明，扬麦38对条锈病表现为近免疫(反应型“0；”)，而轮回亲本扬麦16表现为感病(反应型“4”)(图2B)。抗性鉴定结果与分子标记检测结果一致(图2C和2D)。两年度赤霉病抗性鉴定结果表明，扬麦38对赤霉病的抗性显著高于轮回亲本扬麦16(图2E和表2)，接近于抗病对照品种苏麦3号(表2)。

A：扬麦38和扬麦16的白粉菌接种鉴定表现；B：扬麦38和扬麦16的条锈病自然发病情况；C:标记MBH1的PCR扩增产物电泳结果；D：标记WE173的PCR扩增产物电泳结果；E:扬麦38和扬麦16的赤霉菌单花滴注接种表现。C图和D图中1～5为扬麦38，6～10为扬麦16。

表2 赤霉病抗性鉴定结果Table 2 Evaluation of Fusarium head blight resistance

2.3 产量鉴定结果

扬麦38在长江中下游国家品种比较试验中，2016-2017年度比扬麦20(对照品种)增产 6.90%；2017-2018年度比扬麦20增产8.17%，两年度综合排名第1位。扬麦38在国家区域试验中，2018-2019年度比扬麦20增产5.72%，2019-2020年度比扬麦20增产4.89%，两年度平均产量 6 584.48 kg·hm，比扬麦20增产 5.31%；2019-2020年度在生产试验中，扬麦38比扬麦20增产7.66%(表3)。该品种稳产性好，在5个试验中比对照扬麦20均增产≥2%，≥2%点次率介于78.9%～100%之间；抗倒伏性较好，株高85 cm左右，倒伏不严重点次率在4个试验中均为100%，1个为89.5%(表3)。产量结构合理，两年度区域试验的平均有效穗数为445.5×10·hm，穗粒数为40.9粒，千粒重为41.3 g。

表3 扬麦38在长江中下游国家品种比较试验、区域试验和生产试验中的产量表现Table 3 Yield of Yangmai 38 in comparative tests,regional tests and production tests in the middle and lower reaches of Yangtze River

2.4 品质鉴定结果

国家区试品质鉴定由农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)负责完成，综合2年度区试品质检测结果，发现扬麦38属于弱筋小麦类型(表4)。同时，国家小麦改良中心扬州分中心对扬麦38及其轮回亲本扬麦16的关键品质指标也进行了比较，结果显示，扬麦38的硬度指数、粗蛋白含量、湿面筋含量、面团稳定时间、SDS沉淀值和吸水量均显著低于轮回亲本扬麦16(表5)，是典型的弱筋小麦类型。

表4 扬麦38在长江中下游区域试验中的品质鉴定结果Table 4 Quality test of Yangmai 38 in the regional tests in the middle and lower reaches of Yangtze River

表5 扬麦38与轮回亲本扬麦16的品质鉴定结果Table 5 Quality test of Yangmai 38 and the recurrent parent Yangmai 16

3 讨 论

3.1 关于分子标记的效率

分子标记辅助选择已成为小麦育种的常规技术，标记选择效率是决定该技术能否实际应用的关键。在扬麦38的育成过程中，由于抗白粉病基因检测标记来自基因本身启动子，抗条锈病基因检测标记与其紧密连锁，二者靶向性好，同时均为共显性标记，可以直接在BCF分离世代直接筛选出目标基因纯合的个体，省去了大量的多代标记辅助鉴定工作，标记选择效率得到显著提高。

在对软质基因的筛选中，由于前期已验证轮回亲本扬麦16为突变型的硬质麦(硬度指数达60)，而供体92R137为野生型的软质麦(硬度指数30)，因此为筛选籽粒软质后代，直接利用硬质基因显性标记进行筛选，通过直接筛除BCF代标记阳性的个体，保留纯合基因型。

综合3个标记结果，可以在BCF低世代实现3个基因全部纯合的聚合单株，这种标记辅助聚合育种方法大大提高了对目标基因型的选择效率，从而可使育种家在后续世代育种中专注于农艺性状和产量的选择。

3.2 关于赤霉病抗性的选择

小麦赤霉病是长江中下游麦区的最重要病害，抗赤霉病遗传研究一直是该麦区小麦抗病育种的基础。近年来，主效抗赤霉病基因和相继被克隆，为标记辅助培育抗病品种提供了机会，其中利用进行抗赤霉病遗传改良的实践较为广泛。但在长江中下游赤霉病重发区，单一的基因的效应有限，难以根本解决该麦区小麦赤霉病问题。其次，通过标记辅助聚合抗赤霉病QTL策略育成抗赤霉病品种的实例较少，原因之一是效应明确可靠且达到育种要求的抗赤霉病QTL太少，二是过多的微效QTL聚合易损害对产量、农艺、品质等性状的选择权，对现实育种的贡献并不大。

江苏淮南地处长江下游，雨水丰沛，小麦生长中后期罹患赤霉病风险极高，赤霉病抗性水平达中抗以上是该地区品种审定的基本要求。长期的赤霉病选择压和品种进化使该地区品种总体抗性水平较高，其中以扬麦158为代表的扬麦系列品种，自上世纪90年代以来一直以赤霉病抗性水平高而著称，且推广品种一般都具有较高的赤霉病本底抗性。本研究以中抗赤霉病品种扬麦16为轮回亲本，感赤霉病种质92R137为供体亲本，在标记辅助聚合、和目标基因的同时，对群体进行赤霉病接种和抗性选择，育成抗性接近苏麦3号的小麦新品种扬麦38。在2020年国家小麦产业体系鉴定的全国育成品种(系)中，扬麦38的赤霉病抗性高居第二位。因此，充分利用扬麦本底抗性的同时兼顾数量性状的超亲优势，在赤霉病抗性育种中完全可行。

3.3 关于弱筋小麦品质指标的探讨

弱筋小麦一般要求有较低的籽粒硬度、蛋白质和湿面筋含量、较短的面团稳定时间、较小的溶剂保持力(SRC)等。蛋白质和湿面筋含量2个指标受施肥模式和施氮量的影响显著，在实际育种中仅作为参考指标。籽粒硬度稳定性好，遗传力高，在弱筋小麦品种选育中应予以重视。在本研究中，低世代利用硬度基因功能标记Pinb-D1b对软质麦进行筛选，取得了预期的效果。

中国弱筋小麦需求量持续攀升，但现有的弱筋小麦品种综合抗病性还不强，影响其绿色生产。扬麦38实现了优质弱筋与绿色多抗相结合的突破，将为弱筋小麦绿色生产和相关产业链的培育提供重要的品种支持。