硫酸盐还原菌的分离纯化及脱硫性能研究

孔赟，叶建龙,2, 杜昊臻，李哲天，鲁浩，贺武明，廉晶晶，陈奇

1.长江大学资源与环境学院，湖北 武汉 430100 2.贵州大学资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025

硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一类能通过异化作用将硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等含硫氧化物作为有机物的电子受体还原成硫化氢的厌氧微生物[1-3]，其在石化含硫废水、矿山含硫废水及高浓度有机含硫废水中应用极为广泛[4-7]；同时，该类微生物还原产生的硫化氢可对金属产生腐蚀作用[8,9]。目前在废水处理领域报道的已有9个属，其中弧菌属(Desulfovibrio)和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)最为常见[1,10-13]。

针对石化含硫废水污染日益严重、污染组分繁多、可生化性能差等问题，从提高石化含硫废水处理效果和安全高效微生物脱硫技术角度出发，通过分离培养出纯度高的SRB菌种，考察不同环境因素对其脱硫性能的影响，以期为石化含硫废水的零排放治理技术和资源化利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

含油污泥及石化废水于2018年7月取自江汉油田采油厂潭34站、广9站和花园站油井三相分离器，共采集油泥和废水样品6个，采集后于—20℃低温冰箱保存待用。

SRB菌种富集培养基(液体培养基)：蛋白胨 10g、牛肉膏 5g、NaCl 5g、FeSO4·7H2O 0.5g和蒸馏水1L。

筛选培养基(固体培养基)：K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 1g、MgSO4·7H2O 0.06g、Na2SO42.5g、CaCl2·2H2O 0.06g、柠檬酸三钠0.3g、乳酸钠4g、酵母膏1g、琼脂20g和蒸馏水1L。培养基用0.1mol/L或1mol/L的HCl将pH调节为6.3后，分装至三角瓶中，放入高压灭菌锅于121℃灭菌20min，冷却后取出待用。

硫酸盐溶液配制：准确称量1.4479g的FeSO4·7H2O置于烧杯中，蒸馏水溶解，倒入500mL容量瓶中定容，获得硫酸盐质量浓度为1000mg/L(以硫酸根质量浓度计)的母液备用；硫酸盐去除效果实验中硫酸盐溶液质量浓度采用该母液进行稀释。

1.2 试验方法

1.2.1 SRB分离纯化

在超净工作台分别取5g含油污泥或5mL石化废水接种至盛有100mL富集培养基的三角瓶中，于恒温生化培养箱中28℃条件下富集培养4～6d，当观察到液体培养基大部分变黑且略微有臭鸡蛋气味产生时，表明SRB已大量繁殖；随后采用稀释涂布-叠皿夹层法和划线法于筛选培养基上进行分离纯化[2]，并获得单一菌落。

1.2.2 SRB生理生化实验

革兰氏染色实验参考文献[18]，碳源和氮源利用实验参考文献[19]。

1.2.3 SRB脱硫实验

1)不同菌株对硫酸盐去除效果的影响。将不同SRB分别接种1～2环至盛有100mL富集培养基的三角瓶中，于28℃、100r/min转速条件下恒温培养48h得到发酵液；各取不同SRB菌株发酵液5mL分别加入100mL硫酸盐质量浓度为200mg/L的三角瓶中，置于30℃恒温培养箱中静置培养，48h后测定硫酸盐质量浓度。

2)菌株SRB-X2体积分数对硫酸盐去除效果的影响。按体积比取适量SRB-X2发酵液(0.5%、1%、3%、5%和10%)分别加入100mL质量浓度为200mg/L的硫酸盐溶液于三角瓶中，置于30℃恒温培养箱中静置培养，定期测定硫酸盐质量浓度。

3)温度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响。取5mL菌株SRB-X2发酵液加入100mL质量浓度为200mg/L硫酸盐溶液于三角瓶中，分别置于15、25、30、35、45和55℃的恒温培养箱中静置培养，定期测定硫酸盐质量浓度。

4)pH对菌株SRB-X2脱硫效果的影响。用0.1mol/L的HCl(或NaOH)将100mL硫酸盐溶液(初始质量浓度为200mg/L)的初始pH分别调节至3、5、6、7、8、9、11，随后取5mL菌株SRB-X2发酵液分别加入上述三角瓶中，置于30℃恒温培养箱中静置培养，48h后测定硫酸盐浓度。

5)硫酸盐质量浓度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响。各取5mL菌株SRB-X2发酵液分别加入100mL质量浓度为50、100、200、500、1000mg/L硫酸盐溶液于三角瓶中，置于30℃恒温培养箱中静置培养，定期测定硫酸盐质量浓度。

1.3 分析方法

硫酸盐质量浓度采用离子色谱法测定[4]。硫酸盐去除率计算式如下：

(1)

式中：R为硫酸盐去除率，%；C0和C1分别为初始硫酸盐质量浓度和处理后硫酸盐质量浓度，mg/L。

2 结果与讨论

2.1 SRB菌株分离纯化及生理生化特性

从油泥和废水样品中共分离获得16株纯菌，菌株命名见表1，其中SRB-M8、SRB-D5、SRB-D6、SRB-D7和SRB-D8不能产生硫化氢，其余11株均具有产硫化氢活性，即为硫酸盐还原菌。进一步考察了各菌株碳源利用、氮源利用及革兰氏染色情况，结果表明，除SRB-M8不能利用葡萄糖和碳酸氢钠外，15株SRB菌均能够有效利用甲醇、乙醇、葡萄糖和柠檬酸三钠等有机碳源及碳酸钠、碳酸氢钠等无机碳源；同时可以利用氨氮作为氮源，但不能以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一电子受体进行生长代谢；革兰氏染色结果显示，产硫化氢菌株中SRB-M2、SRB-M3、SRB-M7、SRB-X1、SRB-X2和SRB-X3为革兰氏阳性菌，其余为革兰氏阴性菌。

表1 SRB菌株生理生化特性

不同硫酸盐还原菌能够利用的碳源种类有所差异。万海清等[20]研究表明，脱硫弧菌属能以甲醇、乙醇、乳酸、葡萄糖等有机物作为良好碳源，且消耗速率大小为乳酸>乙醇>甲醇>葡萄糖；SRB菌株BQ1可利用甲酸钠、乳酸钠、乙酸盐等多种碳源[4]，SRB菌株WJ1则可利用丙酸钠、乳酸钠、乙酸盐等多种碳源[14]。部分学者依据SRB碳源利用特征将其分为2大类[1,2,6]：第1类是可以利用乳酸、丙酮酸、乙醇或脂肪酸将硫酸盐还原为硫化氢且不产生二氧化碳的微生物，包括脱硫弧菌属、脱硫肠状菌属、脱硫叶菌属及脱硫单胞菌属等；第2类是将硫酸盐还原为硫化氢的同时可以彻底将乙酸、草酰乙酸、乳酸或富马酸等有机物氧化为二氧化碳和水的微生物，包括脱硫线菌属和脱硫球菌属等。鉴于分离的11株SRB均能利用甲醇、乙醇、柠檬酸等有机碳，推测分离获得的SRB属于第一类微生物。

2.2 不同菌株对硫酸盐去除效果的影响

SRB对硫酸盐的还原能力一定程度反应了菌株脱硫能力，研究考察了11株SRB的脱硫能力，结果见图1，11株SRB对硫酸盐均有去除效果，但在48h内对硫酸盐的还原能力差异较大，去除率为(45.7±2.8)%～(92.1±5.2)%，其中菌株SRB-X2对硫酸盐的还原能力最强，平均去除率高达92.1%。杜刚等[2]从环境样品中分离纯化得到9株SRB菌株，其中菌株SRB-12(Desulfovibriooxamicus)还原能力最强，对初始质量浓度为1700mg/L的硫酸盐处理60h后去除率高达88.8%，其去除率略低于菌株SRB-X2。

图1 不同菌株对硫酸盐去除效果的影响

2.3 菌株SRB-X2体积分数对硫酸盐去除效果的影响

菌株SRB-X2体积分数对硫酸盐去除效果的影响见图2，当SRB-X2体积分数为10%时，对硫酸盐的去除效果最佳，去除率高达98%且不随反应时间的延长而变化。当SRB-X2体积分数为0.5%～5%时，硫酸盐去除率随着菌液体积分数的增加及处理时间的延长而增加，且不同菌液接体积分数(0.5%、1%、3%、5%)对硫酸盐的去除率在72h时最高，分别为(42.5±3.7)%、(57.5±4.2)%、(83.2±4.5)%和(97.3±3.2)%。鉴于当菌液体积分数为5%和10%时，在72h对硫酸盐的去除效果相当，后续试验采用SRB-X2的体积分数为5%进行。

图2 菌株SRB-X2体积分数对硫酸盐去除效果的影响 图3 温度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

2.4 温度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

SRB通常分为中温SRB和嗜热SRB，其最适宜生长温度分别为28～38℃和54～70℃[20]。为考察菌株SRB-X2最佳脱硫温度，比较分析了不同温度条件下其对硫酸盐的去除效果(见图3)，结果显示，菌株SRB-X2在15～55℃范围内均可生长且对硫酸盐的去除率为67%以上，其中30℃去除率最佳，反应48h时去除率高达(99.3±0.6%)，表明菌株SRB-X2属中温菌，其生长温度为25～35℃，最佳温度为30℃。杨春璐等[4]从渤海湾某高温油田采出水中分离获得1株耐高温、耐盐SRB菌株BQ1，其可在14～70℃条件下生长代谢，且在30℃培养时产生的硫化氢浓度最大，表明菌株BQ1在30℃时脱硫效果最佳，该菌株脱硫的最佳温度与SRB-X2一致。

2.5 pH对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

酸碱性直接影响硫酸盐还原酶系统的构象、性质及生物学活性，其对SRB脱硫性能影响较大[20]。pH对菌株SRB-X2脱硫效果的影响见图4，pH由3增加至11时硫酸盐的去除率呈现先增后减的变化趋势，脱硫效果最佳pH为6～7，去除率高达98.5%。杨春璐等[14]研究发现，菌株WJ1在pH为5～10时可生长且能产硫化氢，其最适pH约为8；当pH小于3或高于11时几乎不能产生硫化氢；而菌株BQ1仅在pH为6～9时可产生硫化氢，最适pH为7[4]。综合比较发现，菌株SRB-X2对环境pH适应能力较强。

图4 pH对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

2.6 硫酸盐质量浓度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

考察了硫酸盐质量浓度范围为50～1000mg/L时菌株SRB-X2的脱硫能力，结果见图5。分析可得，株菌SRB-X2能够有效去除硫酸盐且去除率高于65%，在相同处理时间的条件下硫酸盐的去除率随着起始浓度的增加而逐渐降低。当起始质量浓度为1000mg/L时，SRB-X2在24、48、72h对硫酸盐的去除率分别为(68.1±3.6)%、(68.3±3.2)%和(67.5±2.1)%，反应时间对硫酸盐的去除效果无明显影响；当起始质量浓度低于200mg/L时，硫酸盐的去除率随着反应时间的增加显著增加，其中当硫酸盐起始质量浓度为200mg/L时菌株SRB-X2在24、48、72h对硫酸盐的去除率分别为(85.7±3.9)%、(91.8±3.6)%和(95.6±3.2)%，表明脱硫效果较好。

图5 硫酸盐质量浓度对菌株SRB-X2脱硫效果的影响

3 结论

采用稀释涂布-叠皿夹层法和划线分离法从江汉油田含油污泥和石化废水中筛选获得多株硫酸盐还原菌，并重点考察了不同影响因素对菌株SRB-X2脱硫性能的影响，得到主要结论如下:

1)分离所获得的11株SRB菌株均能够有效利用甲醇、乙醇、葡萄糖和柠檬酸三钠等有机碳源及碳酸钠、碳酸氢钠等无机碳源；同时可以利用氨氮作为氮源，但不能以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一电子受体进行生长代谢；菌株SRB-M2、SRB-M3、SRB-M7、SRB-X1、SRB-X2和SRB-X3为革兰氏阳性菌，其余为革兰氏阴性菌。

2)菌株SRB-X2对硫酸盐的还原能力最强。当SRB-X2菌液体积分数为0.5%～5%时，硫酸盐去除率随着菌液体积分数的增加及处理时间的延长而增加，且菌液体积分数为5%的处理组对硫酸盐的去除效果最佳，在72h的去除率为(97.3±3.2)%。

3)温度、pH和硫酸盐初始质量浓度对菌株SRB-X2脱硫性能具有显著影响。株菌SRB-X2最佳脱硫温度为30℃，pH为6～7；该菌株能够有效去除初始质量浓度为1000mg/L的硫酸盐且去除率高于65%，在相同处理时间情况下硫酸盐的去除率随着初始质量浓度的增加而逐渐降低，其中硫酸盐初始质量浓度为200mg/L时，24、48、72h的去除率分别为(85.7±3.9)%、(91.8±3.6)%和(95.6±3.2)%，脱硫效果较好。