饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌肉品质、糖酵解水平和抗氧化能力的影响

杨密,宋宇朵,陈瑞,刘强,周岩民,庄苏*,周国波,杨文武

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.宜兴市天石饲料有限公司,江苏 宜兴 214258)

随着人们物质生活水平的提高,消费者对鸡肉品质有了更高要求。因此,以生长缓慢、肉质鲜美为特点的优质肉鸡市场份额在持续稳步增长。随着育种技术的进步,优质鸡的生产性能不断提高,但其肉品质却呈现降低的趋势。因此,寻找并发现能充分发挥优质鸡肉品质潜力的饲料添加剂,利用营养手段提高肉鸡的附加值具有重要意义,其中甜菜碱因其营养和生理功能在肉鸡生产中应用具有重要价值。

甜菜碱又名三甲基甘氨酸,可从甜菜中提取得到。它具有双电荷性质和3个活性甲基,是动物机体内重要的甲基供体,能够参与蛋氨酸-同型半胱氨酸循环[1],有效调节脂质代谢[2]和蛋白质代谢[3]。甜菜碱同时也是一种重要的有机渗透剂,可以防止细胞脱水,保持水分平衡[4-5]。研究发现饲粮中添加甜菜碱能够降低快速生长型肉鸡[6]、肉鸭[7]、羔羊[8]肌肉的蒸煮损失与滴水损失,增加保水能力。但肌肉内部水分(结合水、不易流动水和自由水)与蛋白质、脂肪等非水组分的结合方式十分复杂,其中不易流动水和自由水的比例会直接影响肌肉的保水能力[9],因此我们推测甜菜碱可能通过影响肉鸡肌肉内部不同状态水分的变化来提高肌肉的保水能力,从而提升肌肉品质。此外,肌肉的糖酵解水平和抗氧化能力是评价动物肉品质的2个重要指标[10-13]。动物致死后肌肉开始糖的无氧酵解过程,乳酸则会在肌肉中大量积累使肌肉pH值快速下降,而肌肉最终pH值过低将导致肌肉保水能力下降和肌肉品质变差[14]。研究证实,补充甜菜碱可减少马运动后肌肉中乳酸积累[11],调节肉鸡在运输过程中造成的肌肉厌氧糖酵解过程[10]。这些结果提示甜菜碱可能影响肉鸡死后糖酵解代谢。当肌肉的抗氧化防御能力被过氧化机制所压制时,会导致抗氧化酶活性降低甚至失活、肌肉脂质过氧化等情况发生,从而引起肌肉氧化损伤[15]。前人研究表明,当肉鸡饲粮在缺乏蛋氨酸或在热应激条件下,饲粮中补充甜菜碱均可增加肉鸡肌肉的抗氧化能力[12-13],降低肌肉氧化损伤。核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞氧化应激反应中的关键转录因子,可调节下游抗氧化酶与蛋白的表达,发挥缓解抗氧化损伤作用,从而改善畜产品品质[16-17]。然而,有关甜菜碱是否由Nrf2介导对肉鸡肌肉抗氧化酶基因的调控作用研究较少。目前有关报道甜菜碱在肉鸡饲料中的应用研究主要以快速生长型肉鸡(如AA肉鸡)为主,而对优质肉鸡(慢速生长型肉鸡)饲料中的应用研究则鲜有报道。雪山草鸡作为一种慢速生长型肉鸡,因其味鲜质优而深受广大消费者青睐。为此,本试验以雪山草鸡为试验对象,研究饲粮甜菜碱水平对其肌肉品质、糖酵解水平和抗氧化能力的影响,为其在慢速生长型肉鸡饲粮中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

试验用甜菜碱为无水甜菜碱(C5H11NO2),由江苏省宜兴市天石饲料有限公司提供,纯度为96%。选用初始体重为(32.0±0.1)g的1日龄雪山草鸡母鸡400只(购自江苏立华畜牧股份有限公司),按完全随机分组原则均分为5组,每组8个重复,每个重复10只。试验期102 d。肉鸡在密闭鸡舍内3层叠层笼养(笼子规格:110 cm×60 cm×50 cm),每笼1个重复10只鸡,自由采食粉料和饮水,每天光照23 h,黑暗1 h。按常规免疫程序免疫。

1.2 试验日粮的组成与营养水平

根据肉鸡不同饲养阶段营养需求,配制以玉米-豆粕为主的4期基础饲粮。基础饲粮组成和营养组成水平见表1。各组肉鸡分别饲喂基础日粮(对照组)或在基础日粮中添加125、250、500和1 000 mg·kg-1甜菜碱的试验日粮,料型为粉料。

表1 基础饲粮原料组成及营养组成水平(风干基础)Table 1 Levels of composition of raw material and nutrient in basal diets(air-dry basis) %

1.3 测定指标和方法

1.3.1 屠宰性能测定在102日龄时,从每个重复组随机选取接近平均体重的雪山草鸡1只,禁食12 h后称体重,随后颈静脉放血处死后称屠体质量,干拔去毛后称胴体质量,最后完整剥离肉鸡两侧无骨、无皮、无脂肪的腿肌,分离腹部皮下脂肪和肌胃周围脂肪,称腹脂重。具体测定指标和计算方法参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法:NY/T 823—2004》[18]中要求进行。

1.3.2 肉品质测定取肉鸡左侧腿肌去除表面脂肪和结缔组织,按Xu等[19]的方法测定肌肉的剪切力、蒸煮损失、滴水损失、pH值和肉色(亮度L*、红度a*与黄度b*值)。

1.3.3 肌肉中水分分布和肌肉质构特征测定按照Zhang等[20]的方法测定相关指标。取2 g的左侧腿肌样品剪碎后放入核磁管中,用PQ-001型脉冲核磁共振分析仪(Niumag电力公司,上海)测定肌肉中结合水、不易流动水、自由水的停留时间(T2b、T21、T22)、峰面积(A2b、A21、A22)和峰面积比(P2b、P21、P22)。沿肌纤维方向将腿肌样品切成1 cm×1 cm×1 cm大小的肉块,使用TA-XT2i型质构仪(Stable Micro Systems公司,英国)测定肌肉硬度、弹性、内聚性、胶黏性、咀嚼性和回复性指标。质构测定条件设置:Pw探头;P50探测模型;探头测前速2.0 mm·s-1,测中速1.0 mm·s-1,测后速2.0 mm·s-1,触发力5.0 g,压缩比50%,探头2次下压间隔时间为3 s。

1.3.4 糖酵解水平和抗氧化能力相关指标测定取0.8 g左右的左侧腿肌样品,用无菌生理盐水溶液1∶9匀浆,4 450g离心15 min后采集上清液,用于测定腿肌中丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和总抗氧化能力(T-AOC),及乳酸、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和丙二醛(MDA)含量。称取0.1 g新鲜腿肌样品加0.3 mL碱液水解,制备糖原检测液用于测定糖原含量。采用BCA法标定肌肉蛋白含量。上述指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。糖酵解潜力根据乳酸和糖原含量计算。计算公式:糖酵解潜力(GP)=2×糖原含量+乳酸含量[21]。

1.3.5Nrf2及相关酶基因表达水平测定取0.4 g左右腿肌样品,按照Trizol试剂盒(TaKaRa)说明提取样品总RNA,用ND-2000分光光度计(Nano-Drop Technologies,美国)检测RNA浓度。用PrimeScriptTMRT Master Mix 20 μL反应体系进行反转录(TaKaRa公司)。荧光定量PCR测定条件和扩增程序参考Xu等[19]的方法进行。以对照组肉鸡腿肌的基因表达量为基准,将β-actin作为内参基因,采用2-ΔΔCT法计算腿肌中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、GPx、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)、CAT、γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(γ-GCLc)和γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(γ-GCLm)基因的mRNA相对表达量。测定试剂盒购自上海皓嘉科技发展有限公司。采用Primer Premier 5.0软件设计基因引物序列(表2),由上海生工生物工程(南京)股份有限公司合成。

表2 实时荧光定量PCR引物对序列Table 2 Primer pairs sequences for real-time fluorescent quantitative PCR

1.4 数据处理

数据经Excel 2010软件初步处理过后,采用SPSS Statistics 20.0中的单因素方差分析法进行方差分析,在差异显著的基础上采用Turkey法进行多重比较以及线性(linear)和二次(quadratic)趋势分析。结果均以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡屠宰性能的影响

由表3可知:雪山草鸡屠宰率随饲粮中甜菜碱添加水平升高呈线性增加(P<0.05),而腹脂率随饲粮甜菜碱添加水平升高呈线性降低(P<0.05)。与对照组比,添加甜菜碱有增加肉鸡屠宰率的趋势(P=0.057);250、500和1 000 mg·kg-1甜菜碱组腹脂率显著低于对照组(P<0.05),但饲粮中添加甜菜碱添加对肉鸡全净膛率与腿肌率均无显著影响(P>0.05)。

表3 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡屠宰性能的影响Table 3 Effects of dietary betaine levels on slaughter performance of Xueshan chicken

2.2 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌肉品质的影响

由表4可知:随饲粮中甜菜碱添加水平提高雪山草鸡腿肌的蒸煮损失线性降低(P<0.05);腿肌的剪切力及24和48 h滴水损失呈线性和二次降低(P<0.05);而腿肌pH24h值呈线性和二次增加(P<0.05)。与对照组相比,甜菜碱组腿肌24与48 h滴水损失显著低于对照组(P<0.05);250、500和1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌剪切力显著低于对照组(P<0.05),125和250 mg·kg-1甜菜碱组腿肌pH24h值显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加甜菜碱对腿肌肉色无显著影响(P>0.05)。

表4 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌肉品质的影响Table 4 Effects of dietary betaine levels on meat quality in thigh muscle of Xueshan chicken

2.3 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌中水分分布的影响

由表5可知:随饲粮中甜菜碱添加水平的提高,腿肌中结合水峰面积(A2b)、自由水峰面积(A22)和自由水峰面积比(P22)呈线性降低(P<0.05),不易流动水峰面积比(P21)呈线性增加(P<0.05),结合水峰面积比(P2b)呈线性和二次降低(P<0.05),结合水最高峰时间(T2b)呈线性增加趋势(P=0.050),不易流动水峰面积(A21)呈二次增加趋势(P=0.072)。与对照组相比,250 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中结合水峰面积比(P2b)显著低于对照组(P<0.05),500和1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中不易流动水峰面积比(P21)显著高于对照组(P<0.05),1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中自由水峰面积(A22)和自由水峰面积比(P22)显著低于对照组(P<0.05)。此外,饲粮中添加甜菜碱并不影响不易流动水和自由水的出峰时间(T21)与(T22)(P>0.05)。

表5 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌水分分布的影响Table 5 Effects of dietary betaine levels on moisture distribution in thigh muscle of Xueshan chicken

2.4 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌质构特征的影响

由表6可知:甜菜碱添加水平线性增加(P<0.05)腿肌的弹性,且500和1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌弹性显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加甜菜碱对腿肌其他质构特征指标无显著影响(P>0.05)。

表6 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌质构特征的影响Table 6 Effects of dietary betaine levels on texture characteristics in thigh muscle of Xueshan chicken

2.5 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌糖酵解水平的影响

由表7可知:随着饲粮中甜菜碱添加水平的提高,腿肌中乳酸含量和GP呈二次降低(P<0.05),PK活性呈线性降低趋势(P=0.090),且500 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中乳酸含量和GP显著低于对照组(P<0.05)。饲粮中添加甜菜碱对其他指标无显著影响(P>0.05)。

表7 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌糖酵解水平的影响Table 7 Effects of dietary betaine levels on glycolytic level in thigh muscle of Xueshan chicken

2.6 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌抗氧化能力的影响

由表8可知:随着饲粮中甜菜碱添加水平的提高,腿肌中CAT活性、T-AOC能力和GSH/GSSG值均呈线性增加(P<0.05),T-SOD活性呈线性增加趋势(P=0.081),GSH含量呈线性和二次增加(P<0.05)且甜菜碱组显著高于对照组(P<0.05),腿肌中GSSG(P<0.05)与MDA(P=0.051)含量分别呈线性与降低趋势。1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中GSH/GSSG值显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加甜菜碱对其他指标无显著影响(P>0.05)。

表8 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌抗氧化能力的影响Table 8 Effects of dietary betaine levels on antioxidant ability in thigh muscle of Xueshan chicken

2.7 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌相关基因表达的影响

由表9可知:随着饲粮中甜菜碱添加水平的提高,腿肌中Nrf2、CAT、GPx和γ-GCLcmRNA表达量呈线性增加(P<0.05)。500和1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中Nrf2mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),1 000 mg·kg-1甜菜碱组腿肌中CAT和γ-GCLcmRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加甜菜碱对其他相关基因无显著影响(P>0.05)。

表9 饲粮甜菜碱水平对雪山草鸡腿肌相关基因表达量的影响Table 9 Effects of dietary betaine levels on the relative gene expression in thigh muscle of Xueshan chicken

3 讨论

屠宰率是评价家禽肉用性能的重要指标,具有巨大的经济价值。腹脂率是评判肉鸡脂肪沉积的关键指标,腹脂沉积增多会降低饲料利用率、影响胴体质量[22]。本试验结果表明,饲粮中添加甜菜碱线性提高雪山草鸡屠宰率,改善胴体性状。结合本课题组之前得到的生长性能结果[23],可以推断屠宰率的提高与甜菜碱提高肉鸡体质量有关。Saunderson等[24]发现,甜菜碱能够提高载脂蛋白转运脂肪的能力,显著降低肉鸡胴体脂肪率。本试验结果与之类似,这进一步证明甜菜碱能线性降低慢速生长型肉鸡腹脂率,有效减少腹脂沉积、改善胴体质量,这一结果可能与甜菜碱改变生长期机体内脂肪代谢有关[2,25]。与前人研究不同的是,本试验未发现甜菜碱对肉鸡全净膛率、腿肌率有显著影响,分析其原因可能与甜菜碱添加量、肉鸡品种、肉鸡生长阶段、饲养时间长短及日粮营养水平有关。

肌肉内部水分可以分为结合水、不易流动水和自由水。结合水与细胞内部的蛋白质紧密结合,对肌肉保水性没有影响;不易流动水存在于细胞内部,其含量增加有助于肌肉持水能力和嫩度的提高;自由水为容易流失的不稳定水,存在于肌肉细胞间隙,其过多流失会导致肌肉持水能力的降低[9,26]。过往研究表明,甜菜碱作为渗透剂可以维持细胞内水分平衡,防止细胞脱水和增加水分滞留[5]。本试验结果表明,饲粮中添加甜菜碱能线性提高腿肌中不易流动水峰面积比(P21),降低自由水峰面积(A22)和峰面积比(P22)。这表明甜菜碱可通过增加肌肉中不易流动水相对含量和降低自由水相对含量来调控水分分布,维持水分平衡,从而降低腿肌蒸煮损失、滴水损失和剪切力,达到提高腿肌持水能力和改善腿肌嫩度。肌肉的弹性主要与肌肉中水分、蛋白质、肌纤维的属性及三者之间的相互作用有关[5,27]。本试验结果表明,在饲粮中补充甜菜碱后肉鸡腿肌的弹性呈线性升高,这一结果可能是由于甜菜碱改善了腿肌的水分分布,降低自由水含量,使肌肉中水分与蛋白质结合更加紧密,肌纤维发生凝聚,最终导致肌肉弹性升高。

pH值对肌肉的肉色、嫩度、保水性和肉的贮藏期都有直接影响。Dong等[8]研究发现,在日粮中添加甜菜碱可二次提高羔羊肌肉的pH24 h值。在本试验中,日粮中添加甜菜碱可线性和二次提高肉鸡腿肌pH24 h值的结果与上述结论基本一致,说明甜菜碱有增加肌肉pH值的作用。宰后糖酵解代谢速率直接影响pH值的下降程度和速率,而糖酵解速率与控制其糖酵解的限速酶HK、PK和LDH等有关[28]。这些酶分别催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸,磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸,然后丙酮酸再转化为乳酸[29-30]。在本试验中,腿肌中乳酸含量和GP随饲粮中甜菜碱添加水平增加呈二次降低,PK活性呈线性降低趋势,该结果表明肌肉中糖酵解程度下降。这也解释了本试验中甜菜碱组肉鸡腿肌pH值升高的原因。Liu等[31]报道甜菜碱可以协助胍基乙酸通过调节能量代谢延缓肌肉糖酵解来改善肉质。Chen等[10]发现甜菜碱通过降低乳酸脱氢酶活性和乳酸含量改变肉鸡运输过程引起的肌肉糖酵解潜能,缓解运输应激对肉鸡肌肉品质的不利影响。这些结果均表明,甜菜碱能够通过调节肌肉糖酵解酶活性,降低糖原分解,减少乳酸积累,进而延缓pH值下降并改善肌肉品质。

氧化应激往往会造成家禽机体氧化还原状态失衡,继而会导致肌肉肉色、质构、风味和营养价值等发生不良变化,导致肉质下降[13]。酶和非酶抗氧化系统是机体主要的抗氧化防御系统,维持着机体氧化还原平衡。T-AOC常用来评价机体或组织整体抗氧化能力。T-SOD、CAT和GPx是酶抗氧化系统重要组成部分,GSH是机体重要的非酶类抗氧化物质,均具有清除超氧自由基和过氧化物以及减少羟基自由基形成的功能[32-33]。GSSG是GSH经氧化后形成的二聚体化合物,通常作为生物体内的一种氧化应激指标,GSH/GSSG值也可作为反映细胞抗氧化的指标之一[34]。本试验研究表明,随着饲粮中甜菜碱添加水平的提高,腿肌中CAT活性、T-AOC能力呈线性提高,T-SOD活性呈线性增加趋势。此外,甜菜碱线性提高了GSH/GSSG值,降低了GSSG含量,线性和二次增加了GSH含量。前人报道,饲粮中添加甜菜碱能够提高肉鸡[6,12-13]、鸭[7]、鱼[35]、羊[33]和猪[2]的抗氧化酶活性,通过增加GSH和GSSG之间的转化循环速率来保证GSH在抗氧化系统的有效作用,提高机体对自由基的清除能力,继而缓解机体组织脂质过氧化,改善肉品质。

为探讨甜菜碱调控肌肉抗氧化能力的机制,本试验检测了腿肌中Nrf2及相关抗氧化酶mRNA表达量。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键转录因子,受其抑制剂Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1的调控,通过与抗氧化反应元件相互作用,调节抗氧化蛋白和下游Ⅱ相代谢酶(包括NQO1、HO-1及SOD、CAT、GPx等)的表达[16,36]。Yu等[33]发现饲粮中添加2.2 g·d-1甜菜碱提高羔羊肌肉Nrf2、CAT、SODmRNA表达量。本试验研究表明,饲粮中添加甜菜碱能线性上调雪山草鸡腿肌中Nrf2与CATmRNA表达量,与上述结果基本一致。甜菜碱在蛋氨酸-同型半胱氨酸循环中可以提供甲基,从而节约蛋氨酸,增加GSH合成所需的底物供应[34]。γ-GCLc酶在催化半胱氨酸和谷氨酸的凝聚形成GSH中发挥了重要作用,有助于减轻机体的氧化损伤[37]。研究表明,甜菜碱通过降低脂肪合成相关基因的表达,来抑制脂肪酸脂化生成甘油三酯[38]。本试验发现甜菜碱显著上调了GPx和γ-GCLcmRNA表达量。冷智贤[39]研究发现,甜菜碱能显著提高热应激条件下肉鸡肝脏中GSH含量和GSH/GSSG值,提高肝脏中GPx活性及基因mRNA表达量。综合以上研究结果,我们推测GSH含量和GSH/GSSG值的增加与甜菜碱上调γ-GCLcmRNA表达量有关。因此,本试验研究结果提示甜菜碱提高肌肉抗氧化能力可能是通过增加Nrf2mRNA表达量,以此介导下游相关抗氧化酶mRNA的表达,从而增加抗氧化酶活力和非酶类抗氧化物质含量。

综上,饲粮中添加甜菜碱可以改善腿肌肌肉水分分布,降低糖酵解潜力,并通过Nrf2介导提高肌肉抗氧化能力,最终改善雪山草鸡肌肉品质。