河南71个重要小麦生产品种的抗叶锈性鉴定

王炜星，张梦宇，董 瑞，张培培，张佳瑶，李在峰，刘大群

(河北农业大学植物保护学院/华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室，河北保定 071001)

小麦叶锈病是小麦生产上的常见病害之一，该病害可通过气流进行远距离传播，在全球范围内分布广泛，条件适宜时可对小麦生产造成严重损失。河南小麦总产量及种植面积居全国首位，为中国小麦主要产区之一。近年来，小麦叶锈病在河南产区发生程度日渐加重，对小麦产量和粮食生产安全造成严重影响。抗病品种长期的单一化种植易导致小麦叶锈病大流行，因此，抗病品种的合理布局与抗病新品种的培育对防治小麦叶锈病以及保证粮食安全至关重要。本研究对河南主要栽培小麦品种进行苗期和成株抗叶锈性鉴定，为小麦抗病基因布局和培育抗病品种提供理论依据和优质抗源。

Loegering等在基因对基因假说的基础上提出了基因推导的方法，该方法通过接种不同毒力的叶锈菌生理小种，将已知抗性基因载体品种(近等基因系)的侵染型与供试材料的侵染型进行对比，推导出供试材料中可能含有的抗病基因。但由于基因推导法易受到叶锈菌生理小种毒力的影响，致使某些基因无法被鉴别，因此，对小麦品种进行抗性鉴定时，可以利用分子标记检测并加以系谱分析的方法对推导结果进行验证，以获得准确结果，目前该方法已广泛应用于小麦品种的抗性基因鉴定研究中。胡长程等、袁军海等和Ren等分别对中国小麦部分生产品种进行了抗叶锈性鉴定，在这些品种中共鉴定出、、、等36个抗病基因。近年来本课题组利用基因推导和标记检测对大量国内外小麦材料进行了苗期及成株期抗叶锈性鉴定，如闫晓翠等、郑慧敏等、Gao等和Gebrewahid等分别对来自陕西、贵州、湖北、四川、江苏、安徽、宁夏的199个国内小麦品种及引进国外的130个小麦品种进行了苗期和成株期抗叶锈性鉴定，共鉴定出、、、、、等39个基因，为这些品种的有效利用奠定了基础。本研究以河南71个主栽小麦品种为试验材料，利用分子标记检测、基因推导和田间抗性调查对其进行抗叶锈性鉴定，以期明确河南主栽品种所含的抗叶锈病基因，为小麦抗病品种的布局防控和优质抗源的发掘利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦材料为36个已知抗叶锈病基因载体(近等基因系)品种、71个河南主栽小麦品种、感病对照品种郑州5389和成株期慢锈对照品种SAAR。16个叶锈菌生理小种为PHJS、PHSP、KHJS、THJS①、THSF、FHSS、THTS、FHJS、PHTS①、PGTS、KHST、THRT、PHSS、PHTS②、THJS②和PHSS，菌种命名利用四字母命名法。供试小麦材料和叶锈菌生理小种均由河北农业大学小麦锈病研究室提供并保存。

1.2 苗期基因推导及抗叶锈性鉴定

苗期试验在温室中进行，将36个已知抗叶锈基因的载体品种、71个河南主栽小麦品种和感病对照品种郑州5389分别播种在16套108孔穴盘内，待培养至一叶一心(第二片叶完全展开)期时，采用扫抹法将16个叶锈菌生理小种接种到16套麦苗上，并在黑暗和100%湿度条件下对接种后的小麦进行密封保湿24 h。将保湿完毕后的小麦放置于温室(25℃左右)内培养，待感病对照品种郑州5389充分发病时(接种后10 d)，对供试材料进行侵染型鉴定。为保证鉴定结果准确，将6级鉴定标准调整为9级侵染型鉴定标准，侵染型等级由低到高依次为0、;、1、1+、2、2+、3、3+和4(0～ 2+为抗病，3～4为感病)。依照Dubin等提出的基因推导方法对鉴定结果进行抗病基因推导。

1.3 田间接种及成株期抗叶锈性鉴定

将供试的71个河南主栽小麦品种、感病对照品种郑州5389和成株期慢锈对照品种SAAR于2014年10月播种于河北保定试验田、2014年10月和2015年10月播种于河南周口黄泛区农场试验田。田间试验采用随机区组设计,2次重复，每个试验品种播种1行(40～50粒)，行长1.5 m、行间距0.25 m，每10行种植1行感病对照品种郑州5389，并在2列试验行之间垂直播种郑州5389作为诱发行。所有田间试验于播种后次年的4月初参照Li等的田间接种方法，利用5个高毒性小麦叶锈菌的混合生理小种(PHJS、THJS①、THSF、FHJS和THRT)分别在河北保定试验田和河南周口黄泛区农场试验田对诱发行进行接种。当郑州5389的叶片侵染面积达到50%时，采用Peterson等提出的方法，对供试材料每 7 d进行1次成株期抗性叶锈鉴定，调查2次。当对照品种达到发病高峰时，所调查的结果作为最终病害严重度(final disease severity，FDS)。

1.4 数据分析

利用软件SAS 9.4对71个河南主栽小麦品种在3个环境下的FDS进行方差分析(ANOVA)和品种间最小显著差异(least significant difference，LSD)值计算，通过比较苗期和成株期侵染型，将苗期对混合毒力菌种表现为感病(IT:3～4)且成株期FDS小于或与慢锈对照品种SAAR无显著差异的品种作为慢锈品种。

1.5 抗叶锈病基因的分子标记检测

利用CTAB法提取71个河南主栽小麦品种叶片的基因组DNA。利用与9个抗叶锈病基因(、、、、、、、和)紧密连锁的的11个分子标记对供试品种进行分子检测。引物序列参照相应文献，由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系均为10 μL，包括5 μL 2×Taq PCR Mix、3 μL ddHO、1 μL 4 mol·μL的上、下游引物、1 μL DNA。9个抗叶锈病基因的PCR扩增程序按照相应的参考文献进行。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

2 结果与分析

2.1 苗期基因推导及分子标记检测结果

36个含有已知基因载体品种的侵染型鉴定结果(表1)表明，携带、、、、、、和的载体品种对16个供试叶锈菌生理小种均表现为抗病(IT：0～2+)，携带、、、、、、、、、和的载体品种对16个供试叶锈菌生理小种均表现为感病(IT:3～4)，因此，这19个抗叶锈病基因无法通过苗期基因鉴定推导出来。

从表1和表2可以看出，对PGTS小种表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，有27个品种(矮丰3号、丰优6号、鹤麦026、花培5号、兰考24、洛麦21、内乡182、内乡188、新麦13、新麦3306、偃师16、偃展4110、豫麦1号、豫麦3号、豫麦52、豫麦53、豫麦7号、豫农035、豫农201、郑麦8998、郑麦9201、周8425B、周麦11、周麦25、周麦26、周麦28和周麦32)也对PGTS表现为抗病，推测这27个品种可能含有。

表1 16个叶锈菌生理小种对36个含有已知抗叶锈菌基因栽体品种的苗期侵染型Table 1 Seedling infection types on 36 wheat lines with known leaf rust resistance genes when tested with 16 P.triticina races

对4个小种(KHJS、FHSS、FHJS和KHST)表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，百农3217、百农64、鹤麦026、内乡188、新麦3306、豫麦47、郑麦366和郑麦8998这8个品种也对这4个小种表现为抗病，推测这8个品种可能含有。

对THRT小种表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，百农3217、百农64、洛旱3号、偃师16、豫麦57、郑麦366、郑麦8998和郑州005这8个品种也对THRT小种表现为抗病，推测这8个品种可能含有。

对5个小种(PHJS、KHJS、FHSS、FHJS和THJS②)表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，内乡188、新麦3306、郑麦366和郑麦8998这4个品种也对这5个小种表现为抗病，推测这4个品种可能含有。

对2个小种(PHSP和THSF)表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，只有豫麦50和周8425B也对这2个小种表现为低侵染性，推测豫麦50和周8425B可能含有。

对3个小种(PHSP、PHTS和PGTS)表现为抗病，71个河南主栽小麦品种中，只有周8425B对这3个小种也表现为抗病，推测周8425B可能含有。

利用11个分子标记对71个河南主栽小麦品种进行检测，结果(表2)表明，百农3217、百农64、鹤麦026等8个小麦品种可以检测出，豫麦50和周8425B可以检测出，矮丰3号、丰优6号、鹤麦026等27个品种可以检测出。以上分子标记结果均与苗期推导结果完全一致。另外，利用连锁标记csLV34在郑麦9694中检测出，而其他抗叶锈基因、、、和在供试材料中未检测到。

表2 16个叶锈菌生理小种对71个河南主栽小麦品种的苗期侵染型Table 2 Seedling infection types of 71 wheat cultivars from Henan when tested with 16 P.triticina races

(续表2 Continued table 2)

2.2 田间成株期抗叶锈性鉴定结果

对71个河南主栽小麦品种在2014-2015年度河北保定以及2014-2015和2015-2016两年度河南周口3个环境下的成株期抗叶锈病鉴定结果显示，感病对照品种郑州5389在3个环境下均充分发病，这保证了鉴定结果的可靠性。对田间鉴定结果进行方差分析，结果(表3)发现，品种间、环境间以及品种与环境间都存在显著差异，这说明小麦成株期抗叶锈性受基因型和环境的共同影响。根据LSD分析结果(表4)，发现共有7个小麦品种(周麦28、周麦11、周麦25、新麦9408、豫农9901、周8425B和鹤麦026)与慢锈对照品种SAAR的严重度无明显差异，表现为成株期抗性，为慢锈品种。

表3 71个河南小麦品种及对照品种SAAR和郑州5389成株期最终病害严重度的方差分析Table 3 Variance analysis of final disease severity(FDS)for 71 Henan wheat cultivars,SAAR and Zhengzhou 5389 at adult plant stage

表4 71个小麦品种在3个环境下对叶锈菌混合生理小种的最终病害严重度Table 4 Final disease severity(FDS)of 71 wheat varieties to mixed P.triticina races under three environments

(续表4 Continued table 4)

3 讨 论

本研究基因推导及分子标记检测结果表明，71个河南主栽小麦品种中，13个品种对所有供试条锈菌生理小种表现为感病，未能检测出已知抗病基因；23个品种对部分条锈菌生理小种表现为抗病，但未能从中检测出已知抗病基因，因此，这些品种中含有尚未确定的抗病基因。基因推导结果和分子标记检测结果一致，保证了鉴定结果的可靠性。

通过系谱分析，周麦11、周麦25、周麦26、周麦28、周麦32、洛麦21和鹤麦026都是周8425B的后代，并且在本研究中均能检测到，而周8425B的亲本山前麦为含有抗叶锈病基因的1B/1R易位系品种。Zhang等在周8425B中鉴定出了，进一步说明这些品种中携带的可能是来自于周8425B。豫麦3号所携带的可能来源于其亲本高加索，该品种是早年我国引入的含有的1B/1R易位系品种，由于其具有优良的抗性和农艺性状，在我国育种中被广泛利用。本研究部分材料中的依据系谱分析，也可推出其来源于携带1B/1R易位系的国外引进材料。此外，百农3217所携带的可能来自于亲本阿夫。本研究检测到郑麦366和其亲本豫麦47都含有，推测郑麦366所携带的来自于其亲本豫麦47。

本研究成株期抗叶锈性鉴定结果表明，周麦28、周麦11、周麦25、新麦9408、豫农9901、周8425B和鹤麦026为成株慢锈品种，可能含有成株期抗叶锈病基因，Zhang等在周8425B中发现了抗叶锈病基因，Yan等进一步克隆了该基因，并发现其为已知抗叶锈病基因，目前在田间对我国叶锈菌生理小种表现出有效抗性，而周麦28、周麦11、周麦25和鹤麦026都是周8425B的衍生系，因此这些品种的成株期抗性可能均来自。

本研究所鉴定出的已知抗叶锈病基因中，、和在我国已丧失抗性；虽苗期对部分条锈菌生理小种表现为抗病，但成株期表现为高感；在苗期对多数条锈菌生理小种表现为感病，但成株期具有一定抗性；在成株期表现为中抗且FDS较高，但在苗期对多数叶锈菌生理小种却表现出有效抗性。多个抗病基因聚合在一起一般可以提供更高和持久的抗性，本研究中部分品种具有多个抗病基因，苗期和成株期也都表现出良好的抗性。另外成株期抗病基因特别是慢锈基因的抗性一般更为持久，因此在育种中可以聚合多个慢锈基因来培育持久抗叶锈性品种。本研究中鉴定到的7个可能携带成株期抗性基因的慢锈品种，可作为抗源用于我国的小麦抗叶锈病育种。