119份春小麦种质萌发期抗旱性鉴定及抗旱相关基因表达特性分析

冯举伶,姚立蓉，汪军成，司二静，杨 轲，李葆春，孟亚雄，马小乐，尚勋武，王化俊

(1.省部共建干旱生境作物学国家重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070)

小麦(L.)是我国主要粮食作物之一，产量高低与国民经济和国家粮食安全息息相关。随着全球变暖的加剧，干旱已成为制约农业生产的主要生态因子，干旱缺水所造成的作物减产远远超过其他非生物限制因素的总和，因而开展小麦抗旱性研究对农业生产具有重要意义。种子萌发是植物生长发育的起始阶段，易受机械损伤、病害和环境胁迫的影响，被认为是植物生命周期中最关键的阶段。种子在干旱胁迫下能否正常萌发直接影响小麦出苗的快慢和质量，进而决定基本苗数及群体结构，并最终影响产量的形成。因此，研究干旱胁迫对小麦种子萌发的影响对小麦抗旱遗传育种和高产栽培具有指导作用。

在干旱、盐碱、高温等非生物胁迫下，植物会启动一系列相应的耐逆机制来抵御环境胁迫。在此过程中，植物各种功能基因和调节蛋白的表达量几乎都会发生变化。小麦在抵御干旱胁迫的过程中，转录因子起到了至关重要的作用。在众多植物转录因子中，NAC转录因子具有多种功能，参与植物生长发育调节及逆境胁迫响应等，目前已有大量该转录因子类基因被克隆研究。如从小麦中克隆的转录因子被导入拟南芥后，转基因植株的抗旱耐盐能力得到了提高。也有研究揭示了转录因子在PEG、NaCl和ABA胁迫下均上调表达，说明在非生物胁迫应答机制上起着重要作用。C2结构域蛋白(C2 domain protein，C2DP)是一类在真核生物中广泛存在的钙依赖性结合蛋白，这些蛋白在结构上具有高度的保守性，可参与一系列信号传导及细胞膜转运调控过程等。小麦基因在ABA、PEG、温度等胁迫诱导下均显著上调表达，因而推测基因也可能参与非生物胁迫的抗性反应。胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA蛋白)是一类在种子胚胎发育后期大量富集的脱水保护因子，可以清除逆境条件下植物体内产生的大量活性氧自由基以及作为调节蛋白参与渗透调节等。从小麦中克隆到的基因受外源ABA、干旱、高盐等胁迫诱导表达，且其转基因拟南芥比野生型更耐旱。基因在小麦的根、茎、叶等组织受到非生物胁迫诱导时也能大量表达，并且对细胞起到保护作用。半胱氨酸蛋白酶(CP)作为蛋白水解酶之一，对植物同样至关重要。除了蛋白酶水解以增加植物的抗性外，有些CP还能加快叶片衰老速度和提高植物在不良环境下的敏感性等。在小麦蛋白酶家族中，TaCP是主要上调表达的植物蛋白酶，以此来应对干旱、盐碱、高温等多重胁迫压力。α-淀粉酶(α-AMY)是植物淀粉酶中应用范围最广的一类，在禾谷类种子萌发过程中起主导酶作用，淀粉是禾谷类种子的主要成分，因此禾谷类种子萌发可以看作是淀粉降解的一个过程。小麦基因在干旱胁迫下会上调表达。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧自由基的主要酶，可抵御膜损伤。其与植物抗逆性紧密相关，可用来反映氧化胁迫伤害程度和评价植物的抗逆能力，故对GPXs基因的研究对于提高植物抗逆性具有重要意义。然而，目前关于GPXs的研究多集中在动物组织或细胞中，而对于非生物胁迫下基因表达特性的研究还未见相关报道。

本研究以20% PEG6000溶液模拟干旱胁迫，对119份春小麦材料萌发期的种子发芽势、种子发芽率、根鲜重、根干重、苗鲜重、苗干重、叶鲜重、叶干重、根长和苗长等指标进行测定分析，以期筛选出抗旱型与干旱敏感型小麦类型；并进一步分析与抗旱相关基因、、、、和在抗旱型与敏感型材料萌发期响应干旱胁迫的表达特征，以验证抗旱材料筛选的准确性，以期为后续选育抗旱新品种提供种质资源，为小麦抗旱机理研究提供材料支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

119份春小麦种质材料(表1)，由省部共建干旱生境作物学国家重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室麦类种质创新课题组提供。

表1 119份春小麦种质材料名称及编号Table 1 Name and code of 119 spring wheat germplasms

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发和形态指标测定

选取上述119份春小麦材料中饱满、大小均匀的种子若干，清洗好后均匀摆放于垫有两层滤纸的培养皿中于室温条件下进行萌发，用20% PEG6000溶液对种子进行干旱胁迫处理，以蒸馏水作为对照。培养3 d后测定种子发芽势；培养 7 d后测定种子发芽率，并选取长势均一的幼苗20株测定根鲜重、根干重、苗鲜重、苗干重、叶鲜重、叶干重、根长和苗长等指标，3次重复。

1.2.2 小麦抗旱相关基因的表达量分析

RNA提取与检测以筛选出的2份抗旱型种质和2份干旱敏感型种质为材料，按上述方法用蒸馏水连续萌发7 d后再用20% PEG6000溶液进行不同时长(0 h、1 h、6 h、12 h、24 h)胁迫处理，对根、叶组织采样并迅速置于液氮中，于 -70 ℃保存备用。用RNA Simple Total RNA Kit(TIANGEN，北京)提取上述组织的总RNA，具体操作步骤参考说明书进行，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过核酸测定仪测定RNA的浓度和纯度。

cDNA第一链合成运用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN，北京)进行cDNA第一链的合成，具体操作参考说明书。

qRT-PCR分析依据基因序列，设计、、、、和这6种基因的特异引物(表2)用于其表达特性分析，利用小麦的β-actin基因(GenBank：AB181991)作为内参基因。运用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN，北京)完成qRT-PCR，反应体系(20 μL)：2×SuperReal Premix Plus 10 μL、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、正向引物(10 μM)0.6 μL、反向引物(10 μM)0.6 μL、cDNA(80 ng· μL)1 μL、RNase-Free ddHO 7.4 μL，每个样品设置3个重复。扩增程序：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸32 s，40个循环。待扩增完成后，根据扩增曲线和熔解曲线检测其特异性，并利用2-△△法对基因表达情况进行分析。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3 数据处理

利用SPSS 21.0进行相关性分析、主成分分析、聚类分析等，利用RStudio和Microsoft Excel 2010进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 小麦萌发期抗旱性鉴定及评价结果

2.1.1 干旱胁迫对各指标的影响

20% PEG6000胁迫下，除苗干重之外，其余9个指标的测定值较对照均有所下降(表3)。其中，苗长的下降程度最大，降幅为80.44%；其次为叶鲜重和种子发芽势，降幅分别为79.07%和71.74%；而种子发芽率的降幅最小，为 14.58%。这9个指标的变异系数较对照均增加，其中种子发芽势增加最明显。经配对检验，对照与胁迫处理间各指标差异均显著。这表明20% PEG6000胁迫对小麦种子萌发具有一定的抑制作用，且各指标对干旱胁迫的响应程度存在差异。

表3 20% PEG6000胁迫下小麦萌发期各指标的变化Table 3 Changes of various indices at wheat germination stage under 20% PEG6000 stress

2.1.2 指标间的相关性

经对各指标的相对值(胁迫处理/对照)相关性(表4)分析，种子发芽势与种子发芽率、叶干重、苗长之间，种子发芽率与叶干重之间，根鲜重与根干重、苗鲜重、叶鲜重之间，根干重与苗鲜重、叶鲜重、叶干重之间均呈极显著正相关。根长与叶鲜重、叶干重间均呈极显著负相关，相关系数分别为-0.243和 -0.326。种子发芽率与叶鲜重间，苗干重与叶干重、根长间，叶鲜重与苗长间均呈显著正相关；其余指标间也存在不同程度的相关性。这说明20% PEG6000胁迫下，不同指标间存在较大的信息重叠，仅凭单个指标难以对小麦抗旱能力作出评价，还需进一步对各指标进行综合分析才能更有效地筛出抗旱型小麦种质。

表4 20% PEG6000胁迫下小麦萌发期不同指标相对值间的相关系数Table 4 Correlation coefficients between relative values of various indices at wheat germination stage under 20% PEG6000 stress

2.1.3 抗旱性主成分分析

对各指标的相对值进行主成分分析，共提取到5个主成分(表5)。第一主成分的贡献率最大，达36.89%，其主要特征向量为叶鲜重；第二主成分的贡献率为19.62%，其主要特征向量为种子发芽势；第三主成分的贡献率为12.32%，其主要特征向量为苗长和种子发芽率；第四主成分的贡献率为8.90%，其主要特征向量为苗鲜重；第五主成分的贡献率为6.26%，其主要特征向量为苗干重。这5个主成分的累计贡献率达 83.99%，可以代表所测指标的绝大部分信息，且叶鲜重、种子发芽势、苗长、种子发芽率、苗鲜重和苗干重与主成分有较高的相关性，相关系数分别为 0.90、0.84、0.62、0.60、0.58和0.67，因此可以选择这6个指标作为综合评价供试材料抗旱性的主要鉴定指标。

表5 5个主成分的贡献率及载荷矩阵Table 5 Contribution rate and load matrix of the five principal factors

2.1.4 抗旱性聚类分析

采用隶属函数法计算每个指标的隶属函数值，再进一步计算每份材料的抗旱性综合评价值(值)(表6)，最后根据值进行聚类分析。结果表明，119份供试材料可以分为4大类(图1)。第Ⅰ类为抗旱型种质，只有蒙茬1号这1份材料，值为0.67；其在20%PEG-6000胁迫条件下的苗鲜重、苗干重、叶鲜重和叶干重均显著优于其余材料。第Ⅱ类为较抗旱型种质，包括黑穗、12-122罗布、红秃头等36份材料，值在 0.47～0.60之间。第Ⅲ类为较敏感型种质，包括MS94-1、宁春10号、J90-9等43份材料，值为0.38～ 0.45。第IV类为敏感型种质，包括09594、K250、陇春3939等39份材料，值为0.23～ 0.37，其在胁迫条件下的各种性状表现均较差。

图1 119份春小麦种质的D值聚类图Fig.1 Clustering diagram of D value of 119 spring wheat germplasms

表6 119份供试材料的D值及分类Table 6 D values and types of 119 tested materials

2.2 小麦萌发期抗旱相关基因的表达特性分析

通过qRT-PCR分析，随着胁迫时间的增加，09594、K250、蒙茬1号和黑穗叶片及根系中、、、、和等6个基因均上调表达，表达量均在胁迫24 h时达到峰值，且抗旱材料蒙茬1号和黑穗的基因表达量均高于干旱敏感材料09594和K250。

在PEG胁迫1 h时，在根系中迅速上调表达，而叶片中的表达较缓慢，抗旱材料蒙茬1号根系和叶片中的表达量较对照分别增加了75.12%和48.19%，而敏感材料09594根系和叶片中的表达量较对照分别增加了59.02%和 37.89%；且在其他胁迫阶段根系中的表达量也均明显高于叶片。此外，胁迫24 h时，较抗旱材料黑穗叶片和根系中的表达量突增，均稍高于抗旱材料蒙茬1号(图2A)，说明干旱胁迫24 h可能为黑穗材料萌发期该基因表达的一个突增点，具有一定的时间特异性，但至于胁迫时间大于24 h时，该材料中基因的表达量是否依然会高于抗旱材料蒙茬1号，还需进一步验证。

在胁迫1、6、24 h时，叶片和根系中的表达量均呈稳定上调表达趋势，虽然在胁迫 12 h时，表达量有所回落，但仍显著高于对照；且在叶片中的响应速度和诱导水平均明显高于根系。同样，在胁迫24 h时，较抗旱材料黑穗叶片和根系中的表达量均稍高于蒙茬1号(图2B)，进一步说明干旱胁迫24 h也可能为黑穗材料萌发期基因表达的一个突增点，但当胁迫时间大于24 h时，该材料中的表达量是否也会高于抗旱材料蒙茬1号，仍需进一步验证。

当增加胁迫时间时，在叶片中的上调表达幅度较小，而根系中表达量明显增强，且根系中相对表达量在胁迫12 h时均小幅下降，胁迫24 h后又急剧上升(图2C)。

的诱导表达启动较晚，在胁迫处理6 h才开始出现较大幅度的上调表达，且在根系中的表达量均明显高于叶片(图2D)。

与的诱导表达模式相似，其在小麦叶片中的表达量均明显高于根系。在PEG胁迫1 h时，小麦抗旱材料蒙茬1号和黑穗的在叶片和根系中迅速上调表达，且其表达量在胁迫6 h时均有所回落，胁迫12 h时又急剧上升；而小麦敏感材料09594和K250在胁迫处理6 h时，在叶片和根系中才出现大幅度的上调表达，且其表达量在胁迫12 h时出现回落，胁迫24 h时又缓慢回升(图2E)。与的诱导表达模式相似，其在小麦根系中的响应速度和诱导水平均明显高于叶片(图2F)。

3 讨 论

3.1 小麦萌发期抗旱性鉴定及评价

干旱是春小麦和其他粮食作物生产中面临的主要自然灾害之一，充分挖掘春小麦自身的抗旱潜力，筛选优良抗旱品种，在一定程度上可缓解干旱胁迫对春小麦造成的危害。而种子萌发是植物生命周期中最关键的阶段，是春小麦能够正常生长发育的前提，萌发期的抗旱性关乎其出苗率及后续幼苗生长和形态建成。因此，研究干旱胁迫对不同基因型春小麦品种种子萌发的影响对于指导小麦抗旱品种选育显得尤为重要。

小麦抗旱性是由多基因控制的数量性状，很难用单一指标对其萌发期的抗旱性进行准确评价，可先对相关抗旱指标初步筛选，再利用隶属函数值法进行综合评价。本研究采用主成分分析，在损失较少信息的前提下，筛选出种子发芽势、种子发芽率、苗鲜重、苗干重、叶鲜重和苗长作为评价春小麦萌发期抗旱能力的主要指标。前人对于不同小麦种质萌发期抗旱性的研究也有较多报道。任毅等以-0.5 MPa PEG6000模拟干旱胁迫，对301份冬小麦种质进行种子萌发培养，测定种子发芽势、种子发芽率、种子发芽指数、根数、根长、苗高和胚芽鞘长度，综合评价的结果表明，种子发芽指数、根长和根数可作为小麦萌发期抗旱性鉴定的可靠指标。王敬东等以40份春小麦为材料，15% PEG6000水溶液模拟干旱胁迫，结果发现胚根长可作为春小麦萌发期抗旱性的主要鉴定指标，胚芽鞘长为参考值。张树林等以20% PEG6000水溶液模拟干旱胁迫，认为小麦的芽长、种子发芽势、根鲜重可用于萌发期抗旱性鉴定的筛选依据。孙绿等也采用-0.5 MPa PEG6000模拟干旱胁迫，通过加权隶属函数法对119份冬小麦萌发期抗旱性进行了综合评价，确定种子发芽率、胚芽鞘长、主胚根长、胚根数和干物质重量可作为鉴定小麦萌发期抗旱能力的主要指标。张芳等也在20% PEG6000胁迫下，对83份新疆冬小麦种质进行萌发期抗旱性综合评价，提出胚芽鞘长和最长根长在小麦萌发期抗旱材料筛选中具有指导作用。综上所述，小麦萌发期实验材料、实验环境或研究方法等的不同均有可能造成抗旱指标筛选的差异化。

L：叶片；R：根系；MC1：蒙茬1号；HS：黑穗。L：Leaves;R：Roots；MC1:Mengcha 1;HS:Heisui.图2 20% PEG6000胁迫下小麦不同抗旱基因的表达模式Fig.2 Expression patterns of different drought resistance genes in wheat under 20% PEG6000 stress

3.2 小麦萌发期抗旱相关基因的表达特性分析

小麦在受到干旱胁迫时会感知和传递胁迫信号，启动相关基因的表达，前人关于小麦抗旱基因表达特性的研究已有相应报道。徐仲阳利用qRT-PCR对郑麦9023幼苗中转录因子的表达量进行检测发现，在不同时间段的20%PEG6000胁迫下，表现出极为显著的上调表达，本研究结果与其一致，说明转录因子参与小麦干旱胁迫的响应。肖瑞霞等研究表明，在20%PEG6000胁迫过程中，小麦叶片中的在胁迫0.5 h、6 h、12 h和24 h时均稳定上调表达，本研究结果与其一致，说明该基因可能在小麦抗旱过程中发挥着重要的脱水保护功能。陈娟对基因的研究结果表明，干旱胁迫处理下，2种不同抗旱型小麦叶片中基因表达量显著高于正常组，复水后表达量下降，且苗期、分蘖期、拔节期和开花期的表达量变化趋势一致，受干旱胁迫越严重，基因表达量就越高。而本研究中基因在小麦叶片中的表达量随胁迫时间的增加而升高，而根中表达量在胁迫12 h时小幅下降，胁迫24 h后又急剧上升，表明小麦基因的表达受干旱胁迫的诱导。张炳慧等对干旱胁迫下基因表达特性的研究表明，在西农538和中国春2个小麦品种叶片中，基因在干旱胁迫0～72 h时间段内的表达量均呈“下降-上升-下降”的趋势，且西农538在胁迫至12 h时表达量突增达到了一个最大值，胁迫1、3、6、48、72 h时的表达量均低于对照；而中国春在6 h时表达量突增到最大值，胁迫1、3、48 h时的表达量也均低于对照。而本研究结果表明，小麦基因在干旱胁迫处理1、6、12、24 h时均上调表达，且根系中的表达量均明显高于叶片，与上述结果相比存在一定的差异。陈蕾太等对基因的研究表明，在干旱胁迫条件下，豫农949、豫麦49-198和长4738的α-AMY基因表达量随胁迫时间的增加均会逐渐升高，本文结果与其一致。目前，关于干旱胁迫下小麦基因表达特性的研究还未见相关报道。本研究中，在20%PEG6000胁迫条件下，小麦叶片和根系中的基因均上调表达，上调程度随胁迫时间的增加而提高，且其在根系中的响应速度和诱导水平均明显高于叶片，这可能与根系直接感受渗透胁迫有关。

4 结 论

本研究以20% PEG6000溶液模拟干旱胁迫，通过对119份春小麦种质萌发期抗旱性进行分析，得出种子发芽势、种子发芽率、苗鲜重、苗干重、叶鲜重和苗长可以作为评价春小麦萌发期抗旱能力的主要指标，并筛选出了1份抗旱型材料(值为0.67)、36份较抗旱型材料(值为 0.47～0.60)、43份较敏感型材料(值为 0.38～0.45)和39份干旱敏感型材料(值为 0.23～0.37)。随着胁迫时间的增加，抗旱相关基因、、、、和在小麦叶片和根系中均上调表达，表达量均在胁迫24 h时达到峰值，且、、和在根系中的响应速度和诱导水平均明显高于叶片，而和在叶片中的响应速度和诱导水平更高。此外，抗旱型材料蒙茬1号和黑穗中6种基因的表达量均高于敏感型材料09594和K250，说明上述不同类型材料的筛选是合适的。