不同种植年限对花椒根际土壤理化性质和微生物群落的影响

廖礼彬 石福孙* 张楠楠 陈晓霞 补欢欢 孙福勇

（1. 中国科学院成都生物研究所，成都 610041；2. 阿坝州生态保护与发展研究院，汶川 623000）

植物根际一般是指根系及其周围的土壤环境，根系、根际土壤及土壤中的微生物组成的根际微生态系统对于维持植物的健康生长具有重要作用。对于大田种植作物来说，根际土壤理化性质、微生物群落结构等常随着作物种植年限的延长而发生恶化，从而影响根际微生态系统的物质与能量循环，导致土壤质量下降。研究表明，土壤理化性质恶化、根际微生物区系失衡、自毒物质积累等因素是导致作物连作障碍、病害发生的重要因素，而微生物群落失衡则是其中最主要的因素。

花椒（Maxim.）为芸香科（Rutaceae）花椒属（）植物，原产我国，具有抗干旱、耐瘠薄、根系发达等生物学特性，是重要的调味品、香料及木本油料树种。花椒是一种生长年限较长的经济作物，在一些椒园中常可见树龄30年以上的花椒树。随着种植年限的增加，花椒根腐病的发生和危害也愈发严重，如在种植5年以上的花椒园中，根腐病的发病率可达45%以上，造成大批成年花椒树死亡甚至毁园，且再植的花椒幼苗也难以存活。有关种植年限对花椒根际微生态及功能影响的研究已有一些报道，张文娟等的研究表明长期种植花椒增加了土壤有机碳的矿化量，降低了土壤有机碳的稳定性；杨睿等发现种植年限影响了花椒根际土壤细菌群落的多样性，土壤pH、速效磷随种植年限增加逐渐升高，而有机质、铵态氮等指标先降后升。

岷江干旱河谷区域是花椒的传统种植区及主产区，花椒是当地老百姓增收致富的一种重要经济作物。该区域四川省阿坝藏族羌族自治州茂县段的花椒种植长期以来遭受着根腐病的严重危害，严重影响了当地花椒的产量和品质，花椒根腐病已成为当地花椒产业可持续发展的主要障碍之一。因此，开展不同种植年限对花椒根际土壤理化性质和微生物群落影响的研究，对花椒根腐病防治和产业可持续发展意义重大。磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记分析法是目前研究微生物群落的经典方法之一，其分析基于的磷脂脂肪酸是生物活细胞中重要的膜组分，在细胞死亡后会快速降解，因此相对于其他方法在响应微生物群落中活菌的变化上更为敏感。因此，本研究利用PLFAs 方法分析比较不同种植年限的花椒（1、15、30 a）的根际土壤微生物群落的变化，结合土壤理化性质、土壤酶活性分析，探讨土壤微生物群落及理化性质随种植年限的变化趋势，以期为花椒根腐病的防治、椒园改造等提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年8月，于四川省阿坝藏族羌族自治州茂县，在同一坡地中且耕作管理措施相同的3个邻近花椒园内（31°45′51″N，103°43′52″E，海拔2 200 m），分别选择种植年限为1、15、30 a的花椒植株各6株，采集根际土壤。每个花椒园中分别随机选取生长状况大致相同的花椒树，在选定的花椒植株主干10～50 cm范围内，清除凋落物，用锄头挖土并找到根系，采用抖落法采集10～30 cm深度的根际土壤，每株花椒根部均在4个方向取土，混匀为一个土样后装入自封袋中，作为该株花椒的根际土壤，然后放入冰盒中保存带回实验室；样品在实验室去除动植物残体及石块等异物后分成2份，一份立即开始土壤理化与酶活性分析测定，另一份于冰箱中−20℃保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸检测。

1.2 测定方法

土壤pH值使用pH计进行测定，（土）∶（水）=1∶10；土壤总有机碳（total organic carbon，TOC）采用元素分析仪（德国元素公司:Variou Macro cube）测定；铵态氮（Ammonium nitrogen）采用靛酚蓝比色法测定；速效磷（Available phosphorus，AP）采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定；速效钾（Available potassium，AK）采用乙酸铵浸提—火焰光度法测定。

蔗糖酶（Sucrase）活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以24 h 后1 g 土壤中葡萄糖含量表示；脲酶（Urease）活性采用次氯酸钠−苯酚钠靛酚蓝比色法测定，以24 h 后1 g 土壤中NH-N 的含量表示；酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以24 h 后1 g 土壤中酚的释放量表示；多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性采用邻苯三酚比色法测定，以2 h 后1 g 土壤中紫色没食子素的含量表示。

称取4 g 冻干土样，采用氢氧化钾−甲醇溶液甲酯化法分离提取，用十九烷酸为内标，使用气相色谱/质谱联用仪（美国HP GC7890/MS5975）得到PLFA特征图谱，再根据内标计算PLFA含量（μg·g）参考已有研究成果中的磷脂脂肪酸标记物表征根际土壤中的微生物（见表1）。

表1 表征微生物的磷脂脂肪酸（PLFA）标志物Table 1 The PLFA biomarkers used to characterize microbes

1.3 数据分析

不同种植年限花椒根际土壤微生物群落特征用所测得PLFA 数据计算多样性指数：香农−维纳多样性指数（Shannon-Wiener diversity index，）、辛普森多样性指数（Simpson diversity index，）和Pielou 均匀度指数（Pielou evenness index，）计算公式如下：

式中：N为第种磷脂脂肪酸含量；为磷脂脂肪酸标记物总量。

1.4 数据处理

利用Excel 2016 软件对试验数据进行统计整理，利用SPSS 20.0 软件对不同种植年限花椒根际土壤理化性质、酶活性、PLFA 含量、多样性指数等进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并用LSD 方法比较不同种植年限之间的差异，显著水平为<0.05，采用Pearson 系数进行相关性分析。作图通过OriginPro 9.0完成。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质与酶活性变化

从表2 可知，随着种植年限的增加，花椒根际土壤的pH值出现下降的趋势，30 a时土壤pH值最低（pH=6.77），根际土壤由弱碱性向弱酸性变化。土壤速效磷和速效钾含量随种植年限呈现增加趋势，30 a 时土壤速效磷和速效钾含量与1 a 相比分别显著增加了127.87%和181.45%（<0.01）。蔗糖酶和脲酶活性随种植年限增加呈先增后降的趋势，15 a的活性最大，分别为1 026.75和69.01 μg·g。多酚氧化酶活性随种植年限的增加逐渐降低，15、30 a 时 分 别 显 著 降 低 了39.24% 和62.82%（<0.01）。土壤总有机碳、铵态氮、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活随种植年限的增加无显著性变化。

表2 不同种植年限花椒根际土壤理化性质与酶活性Table 2 Physiochemical properties and enzyme activities of rhizosphere soil of Z.bungeanum of different planting years

2.2 土壤微生物PLFA含量与群落结构变化

不同种植年限花椒根际土壤微生物PLFA 含量的变化如图1 所示，土壤微生物总PLFA、真菌、革兰氏阴性细菌（G）PLFA 含量随种植年限增加呈增加趋势，且在15 a 时已显著增加（<0.05）。与1 a土壤相比，15 和30 a 时土壤真菌含量分别显著增加了44.03%和81.26%（<0.05），G含量分别显著增加了49.63% 和58.20%（<0.05）。革兰氏阳性细菌（G）和放线菌PLFA 含量随种植年限增加呈先增再降趋势，G在15a 时最高（151.71 μg·g）、30 a 时最低（90.29 μg·g），放线菌在15 a时最高（15.21 μg·g）、30 a 时最低（6.90 μg·g）。土壤细菌PLFA 含量随种植年限的增加无显著性变化。

图1 不同种植年限花椒根际土壤微生物类群磷脂脂肪酸含量数值为均值±标准误，不同小写字母表示差异显著（LSD，P<0.05），下同Fig.1 Microbial group PLFA contents in Z.bungeanum rhizosphere soil of different planting years Values are mean±SE，the different lowercase letters indicate significant difference（sLSD，P<0.05），the same as below

不同种植年限花椒根际土壤微生物生物量比值变化如图2 所示。细菌/真菌和革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌（G/G）随种植年限增加呈下降趋势，与1a相比，到30a时细菌/真菌比值显著下降了34.14%（<0.01），G/G比值显著下降了38.87%（<0.01）。细菌/放线菌和真菌/放线菌随种植年限增加呈先下降再升高趋势，均为1 a 最大、15 a 最小，且均为1 和15 a 间差异显著（<0.05）。不同种植年限花椒根际土壤微生物群落多样性指数如表3 所示，随种植年限增加，香农−维纳多样性指数、辛普森多样性指数和Pielou均匀度指数均以1 a最低、15 a最高，但不同年限间无显著差异。

图2 不同种植年限花椒根际土壤不同微生物类群磷脂脂脂酸度含量的比值Fig.2 Ratios of different microbial group PLFA contents in Z. bungeanum rhizosphere soil of different planting years

2.3 土壤微生物的多样性以及土壤微生物与环境因子的相关性分析

对不同种植年限花椒根际土壤微生物类群与土壤理化性质及酶活性之间的相关性分析结果如表3所示，土壤环境因子与微生物群落结构有显著相关性（<0.05）。土壤pH 值与总PLFA、G、真菌、细菌、放线菌呈显著负相关，与G/G呈显著正相关；总有机碳与G、放线菌呈显著正相关，与真菌/放线菌呈极显著负相关。铵态氮与G呈显著正相关；速效磷和速效钾均与总PLFA、G、真菌呈显著正相关，与G/G呈极显著负相关。蔗糖酶与放线菌呈显著正相关，与细菌/放线菌、真菌/放线菌呈显著负相关；脲酶与G呈显著正相关；多酚氧化酶与真菌呈显著负相关，与细菌/真菌、G/G呈显著正相关。酸性磷酸酶、过氧化氢酶与微生物类群及其比值均无显著相关关系。

表3 不同种植年限花椒根际土壤微生物群落多样性指数Table 3 Diversity index of microbial community in Z.bungeanum rhizosphere soil of different planting years

3 讨论

根际微生态系统是植物与土壤之间相互作用最为直接的场所，土壤、根系和微生物三者在其中紧密结合又相互影响，是物质转化和能量流动的活跃区域，土壤理化性质和土壤微生物群落结构是反映该系统正常与否的关键指标。研究表明，作物的长期单一种植会对土壤生态系统产生严重影响，导致作物养分供给与土壤微生物群落结构失衡，进而影响作物的正常生长。

表4 不同种植年限花椒根际土壤微生物生物量与环境因子的相关性Table 4 Correlation analysis of soil microbes and environmental factors in Z. bungeanum rhizosphere soil of different planting years

3.1 土壤理化性质变化

本研究表明花椒根际土壤的pH 随种植年限的增加呈降低趋势，这与刘娇娇等的研究结果相一致。花椒根际土壤随种植年限增加由弱碱性向弱酸性转变，这可能是有机酸等根系分泌物在根际土壤中的不断积累导致的。部分研究者发现长期连作导致土壤中有效养分含量出现降低，但也有研究发现连作导致土壤养分上升而出现累积效益，如吴林坤等发现重茬地黄（）根际土壤中速效磷与速效钾含量显著高于头茬和野生状态土壤，但重茬地黄生长不良、病害严重；王茂胜等发现随种植年限增加，植烟的品质和产量出现下降，而土壤中全氮、全磷、有机质的含量逐渐增加。本研究发现根际土壤速效磷与速效钾随种植年限延长呈增加趋势，这可能是由于随着花椒的生长，根系分泌酸类、植酸酶等的增多有效促进了难溶性养分转化成速效养分，但高种植年限的花椒树体开始衰老导致养分吸收功能出现明显降低，从而引起了根际土壤速效磷与速效钾含量的显著增加。

3.2 土壤酶活性变化

土壤酶活性能够反应土壤生物活性，体现土壤化学性质的转化能力，是衡量土壤肥力水平与质量优劣的一个灵敏指标。蔗糖酶活性可以表征土壤碳氮转化的速率、反映土壤的熟化程度和肥力水平；脲酶活性可表示土壤氮素的供应水平与能力；多酚氧化酶为抗性酶且参与腐殖质的形成。本研究中，蔗糖酶活性、脲酶活性随种植年限增加呈先增后降的趋势，均在15 a 时活性最高，与赵帆等的研究结果相似。花椒具有化感作用且在生长过程中化感物质会在土壤中累积并影响土壤酶活性，从而导致了花椒根际土壤的碳氮转化速率以及氮素供应水平在15 a 时达到顶峰后又开始下降。马云华等的研究结果显示低浓度酚酸类物质使多酚氧化酶活性上升，但高浓度酚酸类物质显著降低其活性。我们的研究发现，多酚氧化酶活性随种植年限增加出现了持续的下降，说明随着种植年限的增加，花椒根际土壤中酚酸类物质浓度可能逐渐升高从而使多酚氧化酶活性下降，导致了花椒根际土壤的抗性和腐殖质形成能力不断减弱。

3.3 土壤微生物群落结构变化

土壤微生物对维持土壤系统稳定性、健康和质量十分关键，土壤微生物群落的结构和组成会直接影响土壤功能的发挥。土壤中细菌/真菌可以反映土壤微生物群落的结构和功能对不同土壤条件的响应。本研究中，随种植年限增加，花椒根际土壤真菌含量呈现增加趋势，细菌/真菌显著下降，这与一些研究结果一致。长期种植单一作物会诱导土壤真菌尤其是土传病害致病真菌的增加，且真菌比细菌更能适应养分贫瘠、酸化的土壤条件，种植年限的增加可能促使花椒根际土壤微生物群落从“细菌型”向“真菌型”转变，可能导致真菌病害的发生和加重。G细菌偏向于利用新鲜有机碳，而G细菌更倾向于使用土壤有机质衍生碳，其比值可以用来指示土壤碳的有效性或土壤营养状况，张冰冰等的研究表明杉木（）人工林土壤G/G会随着土壤碳有效性的增加而降低。花椒根际土壤中G/G随种植年限增加呈显著下降趋势，表明花椒根际土壤碳的有效性可能随种植年限延长而增加。杨睿等对花椒根际土壤细菌群落结构的分析发现耐受菌大部分为G细菌，而致病菌多属于G菌；Yao 等在高种植年限茶树土壤中分离到大量低代谢能力G菌。本研究中花椒根际土壤G/G的变化趋势也表明随着种植年限增加低代谢能力的微生物类群数量增加，根际氧化胁迫耐受菌占比下降使得花椒抗病原菌侵染的能力下降，花椒受到病原菌侵染的风险增大。相关性分析显示土壤pH 值、速效磷、速效钾与总PLFA、G、真菌、G/G呈显著相关关系，多酚氧化酶活性与真菌、细菌/真菌呈显著相关关系，说明随着种植年限的增加，花椒根际土壤pH、速效磷、速效钾、多酚氧化酶的变化是影响土壤微生物群落与组成的主要环境因子，真菌和G的增加及多酚氧化酶活性的降低可能是诱导花椒根腐病发生的重要原因。

4 结论

综上所述，花椒根际土壤理化性质、酶活和微生物群落结构随种植年限的延长发生了显著变化。土壤pH 值和多酚氧化酶呈下降趋势，土壤速效钾和速效磷呈增加趋势。土壤微生物总PLFA、G、真菌PLFA 含量随种植年限增加呈增加趋势，G和放线菌PLFA 含量呈先增再降趋势，细菌/真菌和G/G随种植年限增加呈下降趋势。根际土壤pH、速效磷、速效钾、多酚氧化酶的变化是影响土壤微生物群落与组成的主要环境因子，真菌和G的增加及多酚氧化酶活性的降低可能是诱导花椒根腐病发生的重要原因。根据本文结果，建议对种植年限较长的椒园采取适当的耕作管理措施，如调节土壤pH、均衡肥料配比与施用量等，将有利于改善椒园的土壤微生物群落的结构和功能，提高土壤质量，以促进高种植年限椒树的健康生长，为花椒的科学种植和病害防治产生积极作用。