布雷菲德菌素A对蕨类植物卵发育的影响

郭严冬 曹建国 周义峰 戴锡玲 王全喜 张明霞

（1. 江苏省中国科学院植物研究所，南京 210014；2. 上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

蕨类植物的位置在植物界中较为特殊，是介于苔藓植物与种子植物之间的一个过渡类群，具有孢子体和配子体2 个世代，且2 个世代均能存活，这在植物界是独有的。目前对蕨类植物的研究主要集中在形态学、系统分类以及新分布等方面。水蕨（L.Brongn.）作为蕨类植物的模式植物，其高尔基体和内质网等细胞器较为典型。相关研究结果表明：受精孔是精子进入卵细胞的通道，对研究蕨类植物有性生殖生物学具有重要的作用。课题组在前期研究的基础上推测受精孔的形成可能与卵细胞和腹沟细胞中的多种细胞器（如内质网、高尔基体、囊泡、胞间连丝等）密切相关。但受精孔在蕨类植物中发生的普遍性、细胞发生机制、生物学功能和演化意义等仍未可知。

相关研究结果表明：布雷菲德菌素A（brefeld⁃in A，BFA）可诱导高尔基体的分解，反竞争性抑制蛋白质从内质网中转运至高尔基体，抑制蛋白质从高尔基体的运输。Shaw 等研究发现，BFA对分泌系统（包括高尔基体的变化、大囊泡的形成、内质网匾囊的增多）具有显著效果，阻止了高尔基体分泌物的运输。国内关于BFA 的研究还主要集中在抗癌细胞中的作用等方面，且多数研究集中于动物实验。而关于BFA 对植物的影响，尤其是对植物生殖发育的影响的研究还较少。水蕨因其孢子生活力很强、容易培养、生长速度快、孢子萌发2周后配子体就能达到性成熟、精子器和颈卵器都直接暴露在配子体的表面而易于观察等诸多优点而成为一个很好的研究配子发生和相互作用的模型。鉴于此，本研究使用BFA 处理发育中的颈卵器，通过观察高尔基体、囊泡等细胞器形态上一些可见的变化来探索高尔基体、囊泡等细胞器对卵膜和受精孔形成的影响，进而探索受精孔形成的机制，为蕨类植物生殖生物学的研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

水蕨的孢子于2012 年10 月采自云南西双版纳植物园。将带成熟孢子的叶片收集于标本纸中，置于干燥通风处使孢子自然散落。10 d后将孢子去杂并收集于硫酸纸袋中，置于冰箱中4 ℃保存备用。凭证标本现存放于上海师范大学植物标本室。

1.2 方法

采用参考文献中的方法对成熟孢子进行消毒和培养，用Nikon SMZ1500 解剖镜和Nikon E800光学显微镜进行观察并照相记录，待配子体上长出幼嫩颈卵器后，挑选一批配子体（大于30 个）放入不同质量浓度（5、50、100 μg·mL）的BFA 溶液中，然后转移到培养箱中分别培养10、20、30 h，共9 组，各重复3 次。对照组为未进行任何处理的水蕨配子体（长出颈卵器）。

每隔10 h从不同质量浓度的BFA 溶液中挑选出一批（大于10 个）水蕨配子体放入0.1 mol·L磷酸缓冲液配制的体积分数3%的戊二醛中室温固定6 h，经相同缓冲液冲洗后，用体积分数2%的锇酸后固定2 h。系列丙酮（体积分数50%、70%、90%、100%）脱水后，用Spurr’s 树脂渗透并包埋，经70 ℃聚合9 h 得到包埋块。半薄切片经甲苯胺蓝染色后，用Nikon E800 观察和照相。超薄切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，用Hitachi-600 电镜观察和照相。

高碘酸-锡夫反应（PAS）：半薄切片用自来水浸泡1 min，1%的高碘酸氧化30 min，自来水冲洗，锡夫试剂染色30 min，用自来水冲洗1 min，亚硫酸钠漂洗液漂洗3 次，每次2 min，自来水冲洗3 min，蒸馏水经过，自然干燥，光学显微镜观察并照相。

苏丹黑B 反应：半薄切片用体积分数70%乙醇浸泡1～2 min，用新鲜配制的体积分数0.3%苏丹黑B液（体积分数70%乙醇配制）在40 ℃条件下染色30 min；体积分数70%乙醇分色1 min，自来水冲洗，蒸馏水经过，自然干燥，光学显微镜观察并照相。

2 结果和分析

对制备的9个处理组样品观察后发现：经不同质量浓度BFA 处理不同时间后的水蕨均受到不同程度的影响，其中以50 μg·mLBFA 处理30 h的处理组的各器官表型性状变化较为典型，因此，以该处理组（经50 μg·mLBFA 处理30 h）的样品与对照组（未经BFA 处理）的样品进行比较。观察结果（见图版Ⅰ）表明：对照组发育卵中期的水蕨（见图版Ⅰ：A1）卵细胞较大、呈杯型，细胞核体积也较大、呈弓状，核仁呈圆形，细胞内包含高尔基体、线粒体以及质体等细胞器；卵细胞和腹沟细胞间的受精孔清晰可见，二者间的分离腔内仅有极少量的泡状分泌物。处理组的卵细胞及细胞核整体形态与对照组基本一致，但在细胞核上方和卵膜下方均分布着大量的嗜锇性囊泡，分离腔中充满了絮状物质，核仁中也呈现较小且数量较多的白色泡状物质（见图版Ⅰ：B1）。组织定位显示：对照组的分离腔较空（见图版Ⅰ：A2），处理组腔内染色较深（见图版Ⅰ：B2），高碘酸-锡夫反应（PAS）显示处理组分离腔内充满着多糖类物质（见图版Ⅰ：B3）。对照组受精孔周围的卵膜较厚，有明显的层次，膜下有少量的嗜锇性囊泡，受精孔下方有较多的线粒体和少量的高尔基体分布（见图版Ⅰ：A3～A4）；处理组卵细胞受精孔及其附近的卵膜基本上由数量较多、大小不一的囊泡组成，也有较多的线粒体分布（见图版Ⅰ：B4～B5）。

图版Ⅰ 布雷菲德菌素A对蕨类植物卵发育的影响A1～A4.对照组；B1～B5.处理组；VCC.腹沟细胞；SeC.分离腔；P.质体；N.细胞核；E.卵细胞；NCC.颈沟细胞；FP.受精孔；M.线粒体；EM.卵膜；OM.嗜锇物质PlateⅠ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A1−A4.Control group；B1−B5.Treatment group；VCC.Ventral canal cell；SeC.Separation cavity；P.Plastid；N.Nucleus；E.Egg；NCC.Neck canal cell；FP.Fertilization pore；M.Mitochondrion；EM.Egg membrane；OM.Osmiophilic material

从细胞器看，对照组卵细胞中内质网和高尔基体发达，且数量较多（见图版Ⅱ：A5～A6），而处理组的卵细胞中则基本上观察不到完整的内质网和高尔基体，出现较多的是囊泡和嗜锇性囊泡（见图版Ⅱ：B7～B8）。增加放大倍数可见，对照组的内质网和高尔基体基本完整、连续（见图版Ⅱ：A7），而处理组的高尔基体、内质网已断裂，被断裂的内质网包裹（见图版Ⅱ：B9～B10）。值得注意的是，颈卵器周围的营养细胞中也出现了一个较为明显的变化，对照组细胞中质体分布较为分散（见图版Ⅱ：A8），而处理组营养细胞中的质体则出现“聚集”的现象（见图版Ⅱ：B11～B12）。

图版Ⅱ 布雷菲德菌素A对蕨类植物卵发育的影响A5～A8.对照组；B6～B12.处理组；G.高尔基体；ER.内质网；Ver.膜性囊泡；Vo.嗜锇性囊泡；Ve.囊泡；VC.营养细胞Plate Ⅱ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A5−A8.Control group；B6−B12.Treatment group；G.Golgi body；ER.Endoplasmic reticulum；Ver.Reticulum vesicle；Vo.Osmiophilic vesicles；Ve.Vesicle；VC.Vegetative cell

3 讨论

Keidan 等认为，向对数生长期的紫球藻（）中添加（10～25 μmol·L）BFA 会降低结合多糖和可溶性多糖的含量，但用20 μmol·LBFA 处理稳定期的紫球藻细胞对细胞壁结合多糖形成的抑制效果要强于可溶性多糖，说明BFA 处理浓度和细胞发育时期的不同可能会有略微的差异，但总体的处理效果大致相同。超微结构研究也表明：20 μmol·LBFA 处理细胞16 h 会破坏高尔基体的完整性。本研究中，设置不同的BFA 处理浓度和时间，经大量观察后发现各BFA 处理组的细胞均会受到不同程度的损伤，细胞中的高尔基体和内质网等细胞器的完整性遭到破坏。Cros⁃ti 等的研究结果表明：BFA 处理会抑制蛋白质从高尔基体的运输；Kartusch 等的研究结果表明：BFA 处理会影响分泌系统（包括高尔基体的堆叠、大囊泡的形成以及内质网扁囊的扩展），甚至高质量浓度（60 μg·mL）会导致高尔基体的分解，但对细胞壁无影响。颈卵器卵细胞中的受精孔与内质网和高尔基体密切相关，本研究显微观察表明：BFA 处理后的卵细胞中的高尔基体较少，观察到的几个高尔基体的结构也不完整；内质网结构也遭到了破坏；小囊泡的数量增多，这可能是因为卵细胞中的分泌系统遭到破坏，原本应该被运输到卵细胞上方用于卵膜形成的蛋白质和脂类等物质的结构被破坏，导致形成的卵膜不典型（由多个囊泡堆叠形成）。对照组的卵细胞和腹沟细胞间的物质交换是通过受精孔在线粒体供能的条件下完成的，分离腔基本无分泌物；而处理组的卵细胞由于卵细胞上方的卵膜结构遭到破坏，受精孔形成不典型，卵细胞中的物质会通过整个卵细胞上方卵膜与腹沟细胞进行物质运输，分离腔内充满了分泌物，进而影响整个颈卵器的发育。研究发现，尽管BFA 处理会影响膜分泌系统，会影响小囊泡在高尔基体和内质网上的“出芽”和“融合”，但在高尔基体未被完全分解的条件下，分泌系统仍然会行使其功能；值得注意的是处理组细胞中质体出现聚集现象，这可能是因为BFA 处理会导致膜性细胞器的破坏，包裹淀粉粒的膜数量减少，细胞体通过这种“聚集”来缓解药物所带来的损耗。

相关研究结果显示：较难总结出BFA 处理的推荐抑制浓度，即使在较高浓度的BFA 处理下，仅通过洗脱药物，就可以使细胞表型得到恢复；且对拟南芥（L.Heynh.）的研究中发现BFA处理会导致“BFA-compartments”的形成，即反面高尔基体网络/早期核内体膜的大集合体。本研究中的处理组细胞中基本无高尔基体堆叠，仅有内质网包裹着断裂的高尔基体片段。这也从另一个方面验证了本研究的结论，即处理组卵细胞中的高尔基体等膜性细胞器虽然遭到破坏，但不典型的卵膜和受精孔仍然可以形成，与腹沟细胞的物质运输也可以进行。BFA 具体的破坏程度与受精孔的形成的具体关系，可进一步借助内质网和高尔基体特异性荧光探针进行进一步的研究，以期为明确蕨类植物卵细胞中的细胞器如何分工合作形成受精孔奠定基础。下一步通过洗脱药物观察幼嫩颈卵器（即受精孔还未开始形成），观察受精孔是否可以正常形成，来进一步探索细胞器在颈卵器发育过程中的作用。

综上所述，BFA 会对卵细胞中的内质网和高尔基体等膜性细胞器造成破坏，影响分泌系统的正常功能，进而影响卵膜及受精孔的形成。