松属针叶角质层微形态特征在分类学中的应用

李 俊 段雅萍 蔡秀珍* 王 婷 潘柏含

（1. 湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081；2. 湖南中医药大学，长沙 410208）

现存裸子植物中，松科（Pinaceae）为种类最多、分布最广、占据森林面积和木材蓄积量最大的类群，其特有性较高，且各特有属、种的分布区型常常代表它们所占据的各级区系区。松树是松属（）植物的泛称，为松科中最大的世界性大属，广泛分布于北半球，全球约有110种，几乎占松科种数的50%；我国产22种10变种，分布几遍全国；另引入16种。

松属植物最明显的特征是叶成针状，常2针、3针或5 针一束，每束针叶基部被叶鞘包围，叶内具1～2个维管束和多个树脂道。针叶呈旱生形态，表皮外壁覆盖有发达的非细胞结构的角质层。角质层与表皮细胞紧密结合，植物表皮细胞的形态、排列方式，以及气孔器的形态结构、分布、排列方式、开口方向等形态特征均能在角质层上反映出来。和被子植物相比，裸子植物叶的外部形态和内部结构相对比较稳定，不易受环境变化的影响。在松柏类植物中，叶的外部形态比生殖结构更为一致，它们叶的结构特征具有一定的分类学价值。因此，比较研究松属植物针叶角质层微形态特征，可为该属的分类研究提供新证据。

植物角质层形态特征在分类学上的应用，最早始于英国。迄今为止，国内外学者已对罗汉松科（Podocarpaceae）、松科、柏科（Cupressaceae）、红豆杉科（Taxaceae）、苏铁科（Cycadaceae）和壳斗科（Fagaceae）等植物类群，特别是罗汉松科进行了大量研究。国内有关松属针叶角质层特征的研究，仅见于早期胡玉熹利用扫描电镜观察了松属部分种类针叶角质层的内表面结构，但其研究并未详细描述各供试材料的角质层特点和角质层外表面结构特征。松属是植物分类学上公认的困难类群，应用传统形态学特征对该属进行分类、鉴别，面临着一些困难和挑战；其属下分类，尤其是组级水平上的分类长期存在争议；白皮松的分类地位问题也有待进一步探讨。

因此，本文选取涵盖单维管束松亚属（Sub⁃genus）和双维管束松亚属（Subgenus）共12 种松属植物为供试材料，利用光学显微镜和扫描电镜，对松针角质层内、外表面的微形态特征进行了细致观察，旨在为松属属下分类、种间鉴定，以及属下种类系统地位的确定提供新证据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为海南五针松（）等12 种松属植物（见表1），采于河南省和湖南省等地，凭证标本存放于湖南师范大学植物标本馆（HNNU）。

表1 材料来源和凭证标本Table 1 The origin of materials and vouchers

1.2 方法

野外采集生长良好的新鲜枝条，立即将其置于FAA固定液中浸泡、备用。

制备角质层：参照马清温实验方法，从FAA固定液中选取完整成熟的针叶，取中间部分切成小长条。用30%的过氧化氢（HO）和100%冰醋酸（CHO）处理，水浴锅中60 ℃加热12 h；当角质层与内部组织自然分离时，取出角质层，清除残存在角质层内表面的细胞；用蒸馏水冲洗数次。

光学显微镜观察：松针角质层经酚红染色后，制成临时装片，Olympus BX51 数码显微镜摄像系统和Motic BA210-T 型光学显微镜下，用不同倍数物镜观察角质层形态结构并照相。

扫描电镜观察：松针角质层样品经各级酒精脱水干燥，每梯度间隔30 min。干燥后，用叔丁醇置换2 h 以上。将每个样品角质层的叶近轴面（内表面）和远轴面（外表面）朝上，用导电胶粘贴于铜质样品台上。经JFC-1600型离子溅射仪喷金镀膜后，JSM-IT500型扫描电镜下观察、照相。

本文所用术语主要参照孙同兴和Whang等的报道。

2 研究结果

2.1 松属针叶角质层内表面形态特征

在光学显微镜和扫描电镜下，松属12 种植物针叶角质层内表面特征，在细胞大小、形状和纹饰等方面在不同亚属和组中差异较明显。角质层内表面形态特征观察到的12 个性状，可被划分为与表皮细胞、气孔和表皮毛有关的3 大类型（观察结果见表2，图版：Ⅰ～Ⅱ）。

表2 12种松属针叶角质层内表面形态特征Table 2 Some internal cuticular characteristics of leaves of 12 Pinus species

与表皮细胞有关的性状共涉及6 个：（1）表皮细胞长度；（2）表皮细胞端壁形状；（3）光学显微镜下表皮细胞垂周壁纹路；（4）扫描电镜观察下表皮细胞垂周壁纹路；（5）靠近表皮毛的表皮细胞形态；（6）表皮细胞形状。除白皮松表皮细胞长度相对较短外，其余11 种松属植物的表皮细胞均较长。白皮松的表皮细胞平均长度约为100 μm（图版Ⅰ：1），日本五针松、马尾松、黑松、黄山松和湿地松大部分为200～300 μm（图版Ⅰ：9～18），海南五针松、华南五针松、华山松、火炬松和萌芽松大部分为300～400 μm（图版Ⅰ：3～8，19～22），而长叶松则长达500 μm 以上（图版Ⅰ：23～24）。表皮细胞端壁有3 种形态，以垂直端壁最为常见，较少为倾斜端壁，极少数为锥形端壁。这些端壁形状常共存于一个物种内，所有供试材料均具以上3 种形态端壁，但锥形端壁出现频率较低（图版Ⅰ：1～24）。光学显微镜下，白皮松、海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松表皮细胞垂周壁呈锯齿状或深波状（图版Ⅰ：1～10），马尾松、黑松、黄山松、湿地松、火炬松、萌芽松和长叶松呈浅波状（图版Ⅰ：11～24）。扫描电镜下，白皮松、海南五针松和华山松表皮细胞垂周壁呈波状（图版Ⅱ：1，7），华南五针松和日本五针松呈锯齿状或波状（图版Ⅱ：5，9），马尾松和湿地松不明显（图版Ⅱ：11，17），黑松、黄山松和萌芽松呈直线状（图版Ⅱ：13，15，19），火炬松和长叶松则呈凸出条纹状（图版Ⅱ：19，23）。12 种松属植物的表皮细胞形状由直到弯，由弯到蜿蜒（图版Ⅰ：1～24）。一些靠近表皮毛的表皮细胞形态大小与其他表皮细胞不尽相同：白皮松、华南五针松、马尾松、黑松、黄山松、湿地松、火炬松和长叶松的表皮细胞有变短趋势（图版Ⅰ：1，5，11，13～15，17，19，23）；萌芽松有变窄趋势（图版Ⅰ：21）。

图版Ⅱ 扫描电镜下松针角质层内表面1～2.白皮松；3～4.海南五针松；5～6.华南五针松；7～8.华山松；9～10.日本五针松；11～12.马尾松；13～14.黑松；15～16.黄山松；17～18.湿地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.长叶松Plate Ⅱ Scanning electron micrographs of the inner surface of the cuticles 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

图版Ⅰ 光学显微镜下的松针角质层1～2.白皮松；3～4.海南五针松；5～6.华南五针松；7～8.华山松；9～10.日本五针松；11～12.马尾松；13～14.黑松；15～16.黄山松；17～18.湿地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.长叶松PlateⅠ The cuticles of pine needle under light microscope 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

与气孔有关的性状共有4 个：①保卫细胞形状；②副卫细胞痕迹；③气孔带的连续性；④气孔带之间表皮细胞。气孔器大部分为椭圆形，白皮松气孔器呈短椭圆形（图版Ⅱ：2），海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松气孔器呈椭圆形，副卫细胞痕迹不明显（图版Ⅱ：3～6，8，10）；马尾松、黑松、黄山松、火炬松和萌芽松气孔器呈椭圆形，可见副卫细胞痕迹（图版Ⅱ：11～16，19～22）；湿地松和长叶松气孔器为长椭圆形，可见副卫细胞痕迹（图版Ⅱ：18，24）。大部分供试材料气孔排列均是连续的，仅华南五针松和日本五针松的气孔排列有小部分间断（图版Ⅰ：5，9）。气孔带之间的表皮细胞行数变化很大（0～20 行）。华南五针松、华山松、日本五针松、海南五针松和白皮松气孔带之间的表皮细胞行数个别有为0（图版Ⅰ：1，3，5，7，9），其余种类气孔行之间的表皮细胞行数均大于或等于3行（图版Ⅰ：11～13，15～24）。

与表皮毛有关的性状有2个：①靠近表皮毛的凹槽；②表皮毛长度。本研究中12 种松属植物靠近表皮毛的表皮细胞均易脱落，导致出现凹槽。白皮松、马尾松、黑松、黄山松、湿地松和长叶松在角质层内表面，靠近表皮毛的地方具有一条发达的凹槽（图版Ⅱ：1，11，13，15，17，23），其余种类虽具凹槽但不甚明显，其中海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松的凹槽形状相似（图版Ⅱ：3，5，7，9），火炬松和萌芽松的凹槽形状相似（图版Ⅱ：19，21）。在光学显微镜下，可清楚观察到一个表皮毛的长度，发现海南五针松、华南五针松和华山松的表皮毛长度为300～600 μm（图版Ⅰ：3，5，7），白皮松、马尾松、黑松、黄山松、湿地松、火炬松和萌芽松的表皮毛长度为200～400 μm（图版Ⅰ：1，11，13，15，17，19，21），而长叶松的表皮毛长度为400～600 μm（图版Ⅰ：24）。

2.2 松属针叶角质层外表面形态特征

松属针叶角质层外表面形态特征共观察到8个性状，可分为与表面形态气孔有关2 大类型，详见表3及图版Ⅲ。

图版Ⅲ 扫描电镜下松针角质层外表面1～2.白皮松；3～4.海南五针松；5～6.华南五针松；7～8.华山松；9～10.日本五针松；11～12.马尾松；13～14.黑松；15～16.黄山松；17～18.湿地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.长叶松Plate Ⅲ Scanning electron micrographs of the outer surface of the cuticles 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

表3 12种松属针叶角质层外表面特征Table 3 Some external cuticular characteristics of leaves of 12 Pinus species

与表面形态有关的角质层外表面特征涉及3个性状，即表面起伏、表皮细胞轮廓和表皮毛。12种松属植物针叶外表面纹理有起伏，表皮细胞轮廓可见。其中，海南五针松、华南五针松、日本五针松和华山松的表面起伏和细胞轮廓尤其明显（图版Ⅲ：3～10），白皮松、马尾松和萌芽松表面起伏和细胞轮廓较明显（图版Ⅲ：1，11～21），而黑松、黄山松、湿地松、火炬松和长叶松表面则仅有微起伏、仅能辨别出表皮细胞存在（图版Ⅲ：13，15，17，19）。除日本五针松针叶表皮毛不太明显外（图版Ⅲ：9），其余11种松属植物针叶均明显可见表皮毛（图版Ⅲ：1，3，5，7，11，13，15，17，19，21，23）。

与气孔有关的角质层外表面特征共涉及5 个性状：①伏罗林环（Florin ring）；②沟槽；③针絮状物质；④气孔塞；⑤气孔形状。所有供试材料均具伏罗林环，尤其是白皮松、海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松的伏罗林环特别显著（图版Ⅲ：1～10），而马尾松和黄山松则不太明显（图版Ⅲ：11～12，15～16）。伏罗林环基外侧沟槽在一些松属种类中并不存在，如马尾松、黑松和黄山松等（图版Ⅲ：11～16）；在白皮松、海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松中有微弱发育（图版Ⅲ：1～10）。有些种类气孔会出现气孔塞，如马尾松、黑松和黄山松气孔有一部分有气孔塞（图版Ⅲ：11～15），而白皮松、火炬松和萌芽松气孔大部分都有气孔塞（图版Ⅲ：1，19～22），其余种类则未观察到气孔塞。有些种类气孔旁边具针絮状物质，其中华山松气孔旁较多（图版Ⅲ：8），海南五针松和华南五针松气孔旁较少（图版Ⅲ：4，6），其余种类则没有。外部气孔形状共有5种形态：椭圆形（图版Ⅲ：2）、矩形（图版Ⅲ：20）、多边形（图版Ⅲ：24）、鞋形（图版Ⅲ：8）和圆形（图版Ⅲ：22）。

3 讨论

3.1 松属针叶角质层微形态特征在组水平上的分类价值

《中国植物志》将本研究中12种松属植物归入单维管束松亚属和双维管束松亚属2个亚属，单维管束松亚属下的五针松组（Section）含海南五针松、华南五针松、华山松和日本五针松4种，白皮松组（Section）含白皮松1 种，双维管束松亚属下的油松组（Section）含马尾松、黑松、黄山松、湿地松、火炬松、萌芽松和长叶松7 种；而在《A Handbook of the World’s Coni⁃fers》中，该12种归入与《中国植物志》相同的2个松属亚属，但在组分类上与《中国植物志》有所不同，其分为Section、Section和Section3 组，把五针松组和白皮松组合并为Section，油松组分为Sec⁃tion（马尾松、黑松和黄山松）和Section（湿地松、火炬松、萌芽松和长叶松）2 个组。本研究参考马清温等实验方法，使用过氧化氢和冰醋酸，代替Whang 和Kim 等所使用的三氧化二铬，使得角质层内表面有些地方仍有一层表皮细胞和气孔复合体，从而可以观察到一些新的特征，如靠近表皮毛表皮细胞形态和表皮毛长度等。这些新的特征，亦可为松属在组级水平上的分类提供一些新依据。本研究观察到白皮松表皮细胞和表皮毛长度比五针松组的长度明显要短；五针松组角质层外表面的起伏程度和表皮细胞轮廓均比白皮松明显；白皮松角质层外表面气孔有气孔塞但无针絮状物质，五针松组气孔大部分有针絮状物质但无气孔塞；白皮松角质层外表面气孔均为椭圆形，五针松组气孔至少有2种不同的形态。以上针叶角质层微形态特征在五针松组和白皮松组之间区别明显，笔者认为将五针松组和白皮松组合并为Section是不太合适的。此外，针叶角质层微形态所表现的20 个性状均不支持将油松组分成Section和Section2 个组。松属植物针叶角质层微形态特征具有自身的特异性，可作为属下组级分类的重要依据。

3.2 白皮松的分类学地位问题

蒋辉、李湘萍、陆素娟和宋湛谦等学者认为白皮松组应从单维管束松亚属中独立成白皮松亚属（Subgenus）。在外部形态如树皮和针叶、针叶解剖学如气孔、木材解剖如射线管胞内壁和管胞疣状层、孢粉研究如本体与气囊交界处的夹角、木材中化学物质如多酚物质等、种子油成分如脂肪酸、松脂的成分如树脂酸、细胞学中核型分析、基因中单亲遗传叶绿体DNA等研究中，均表明白皮松确实为松属各种中一个较为特殊的种类，兼有松属2 个亚属的特征或具独特的特征，系一个中间型树种，白皮松的分类学地位问题值得探讨。

本研究结果表明，白皮松的针叶角质层微形态特征在12 种松属中显得尤其特殊，其部分特征与五针松组的特征相同，如：角质层内表面光学显微镜和扫描电镜观察下的垂周壁纹路、无副卫细胞痕迹和表皮毛下凹槽形态，角质层外表面伏罗林环的发育和气孔的沟槽；部分特征与油松组的特征相似，如：角质层内表面靠近表皮毛的表皮细胞形态和表皮毛的长度，角质层外表面气孔旁无针絮状物质和有气孔塞等特征则更加接近油松组；部分特征又不同于其他松属，如表皮细胞长度、角质层外表面起伏和表皮细胞轮廓（除马尾松和萌芽松）和气孔形状。以上特征均体现白皮松在针叶角质层微形态方面的独特性，可为白皮松亚属的建立提供新的论据。

3.3 火炬松和湿地松的种间鉴定

在油松组中，火炬松和湿地松形态极其相似，其树皮均为褐色、鳞片状开裂；枝条均每年生长数轮，小枝为褐色；冬芽圆柱形；针叶均具2～3 针一束并存的现象；球果均圆锥形或窄圆锥形，且有时火炬松和湿地松形成混交林，二者难于鉴别区分。物种形态鉴定之难，在于种间的差异较小，或者由于种间分布区重叠，种间发生着不同程度的基因渐渗杂交，从而使得种间的分类界限模糊，分类鉴定困难；同时有些树种分布范围广，种内常因种源、立地条件、不同年份气象因子而产生更大的差异，这也使得一些种或变异类型的分类学地位长时间处于混乱状态。在扫描电镜下，湿地松针叶角质层内表面的表皮细胞垂周壁纹路不明显，有部分表皮细胞脱落痕迹，火炬松的表皮细胞垂周壁纹路则呈凸出直线条纹状；在针叶角质层外表面，湿地松气孔无气孔塞，火炬松气孔则大部分具气孔塞；湿地松的气孔形状为圆形或椭圆形，火炬松的气孔形状为圆形或矩形。这些针叶角质层微形态特征可为火炬松和湿地松提供种间界定依据。