水稻种子表面消毒方法的比较研究

王朝君，李 乐，张旭梅，叶 超，毛加宁※

（1.乐山师范学院 a.教育科学学院；b.生命科学学院，四川 乐山 614004；2.西安市雁塔区第二小学，陕西 西安 710000）

0 引言

水稻种植有着非常悠久的历史，它是全世界播种面积仅次于小麦的第二大粮食作物。保证水稻的产量以及水稻品种的质量对我国乃至全世界的粮食安全都具有极其巨大的意义。就目前而言，提高水稻产量和改良水稻品质的主要手段有水稻杂交技术和化肥农药的施用。除此之外，探求更加科学的水稻增产方法显得尤为重要。

与宿主植物和谐共生的一类微生物我们称之为植物内生菌[1]。伴随着植物微生态学的深入研究,植物内生菌在植物生长过程中的重要性逐渐显现[2]。经由大量实验证实，植物种子的表面及内部均有丰富的微生物群落[3]。内生细菌对水稻具有固氮、抗病、促生等作用，我国率先在2006年采用内生菌技术培育出了优质高产水稻，创新了通过微生物提高水稻增产的新方法和新研究领域。众所周知，想要通过研磨方法分离植物内生细菌，一定要消除表面微生物的影响[4]。目前常见的消毒方法较多，但是考虑到对水稻种子活性的影响，对水稻种子内生菌分离的影响以及消毒试剂的可获得性，仍趋向采用常见的消毒试剂对其进行表面消毒。然而，水稻内生菌的分离研究才刚刚起步，当前何种消毒方式既能高效灭菌又能减少对水稻内生菌的影响尚不清楚。因此，本研究通过比较水稻种子不同表面消毒方法对内生菌的影响，以寻找适合水稻种子表面消毒的最佳消毒试剂以及其浓度和消毒时间的最适范围。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 水稻种子的采集

试验样品为四川省乐山市农业科学研究院提供的水稻种子中的不育系乐3A，取材时期为成熟期（2016 年9 月）。

1.1.2 药品及试剂

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、无菌水、0.1%升汞（氯化汞）、0.1%硫酸铜、5%双氧水、70%无水乙醇、5%高锰酸钾、活性氯10%的次氯酸钠溶液。

1.1.3 实验器材

LDZX-50FA 立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、电子天平、HPX-9082 MBE 数显电热培养箱（上海博讯实验有限公司医疗设备厂）、SW-CJ-2FD 双人单面垂直净化工作台（南京艾赛特科技发展有限公司）、电子万用炉。500 mL 烧杯和1000 mL 烧杯、1000 mL 锥形瓶（带塞子）、500 mL 量筒、1000 mL 量筒、玻璃棒、培养皿（若干套）、酒精灯、涂布器棒、镊子、移液枪0.01 mL (含枪头)。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备和实验器具消毒

a）培养基的制备。参照沈萍和陈向东主编的《微生物学实验》教材第四版中培养基的制备方法，选择牛肉膏蛋白胨培养基（NA）。

b）实验用具消毒。参照微生物学实验手册对实验工具和培养基做如下灭菌处理，将清洗干净的培养皿晾干后每十套为一组用报纸包裹并进行包扎，再将实验过程中使用到的所有玻璃器皿、移液枪的枪头、装有培养基的锥形瓶用报纸包裹包扎，后置于高压蒸汽灭菌锅中高温灭菌处理。

c）实验仪器消毒。使用前对超净工作台也要进行消毒，用75%的酒精擦拭后再在紫外灯下光照10 min 进行超净工作台的消毒处理。将消毒后的所有实验器材放置在经过消毒处理的超净工作台上备用。

灭菌后的培养基倒入在培养皿上，待其冷凝为固体后用标签纸标上序号待用。

1.2.2 样品表面消毒方法

以不育系稻种乐3A 为实验材料，用电子天平称取若干组种子，每组种子各1 g，取一组称量好的水稻种子放在灭菌后的培养皿中用无菌水冲洗干净，洗去表面灰尘，用吸水纸擦干（取第一次淋洗水稻种子的淋洗液0.1 mL 涂布于NA 固体培养基平板上，在28 ℃培养箱中培养，经过一段时间（48～72 h）后观察消毒水稻种子表面细菌及其数量）。然后依次在70%乙醇、0.1%升汞、0.1%硫酸铜、5%双氧水、5%高猛酸钾、10%的次氯酸钠溶液中浸泡3 min，最后用无菌水漂洗，洗涤大约5 次，从最后一次淋洗种子的无菌水中用移液枪吸取0.1 mL，涂布于NA 固体培养基平板上，培养箱中温度设置28 ℃，培养一段时间（48～72 h），检测样品表面消毒效果，每半天进行观察记录。

选择水稻种子表面消毒效果最好的一组消毒试剂，设置浓度梯度，在不同浓度梯度下分别浸泡水稻种子一定时间（15 s、45 s、5 min、25 min），再用无菌水淋洗5 次，用移液枪吸取最后一次淋洗液0.1 mL 涂布平板，培养箱中温度约28 ℃，培养一段时间（48～72 h）后检测水稻种子表面消毒效果。

以上两组实验均设2 组对照，以此检验表面消毒效果。（a）超净工作台对照。在每组实验过程中，将NA 固体培养基敞开盖子放置，实验结束后将该对照培养基在28 ℃培养箱内培养一段时间（48～72 h）。（b）淋洗液无菌检测对照。取0.1 mL 无菌水涂布于NA 固体培养基上，然后放置在28 ℃培养箱内培养一段时间（48～72 h）检测消毒效果。（c）种子无菌检测对照。在NA 固体培养基上压入经上述表面消毒后的完整种子，让NA 固体培养基与表面消毒的水稻种子接触3 min，移去表面消毒的水稻种子，在28 ℃培养箱内培养，一段时间（48～72 h）后。2 组对照中不长菌或长菌数目最少，其最低消毒强度为最优条件。2 组对照处理可以保证水稻种子表面消毒的准确性和操作过程的无菌环境。通过对比采用了不同的消毒方法后水稻种子表面细菌的数量，从而得出最适消毒方法。

1.2.3 水稻种子表面消毒效果的检查

将在培养箱中培养一段时间（48～72 h）后的培养基取出，在超净台上观察NA 固体培养基表面是否出现菌落以及菌落的种类、数量进行统计和比较，优选后得到水稻种子表面消毒的最优方法。

2 结果与分析

2.1 不同化学试剂的表面消毒效果

利用传统的分离培养方法将水稻种子的漂洗液涂布于NA 固体培养基中，每组平行重复2次，放入数显电热培养箱中(28 ℃)培养一段时间（48～72 h），进行比较观察，若放在超净台上的NA 固体培养基和淋洗种子的无菌水的NA固体培养基没有生长菌落，说明实验试剂以及实验操作环境符合标准，实验过程中不受环境中细菌的沾染影响；若最后一次漂洗液和消毒后的种子的NA 固体培养基没有生长菌落，说明水稻种子表面消毒完整。不同消毒试剂的表面消毒效果如表1 所示，通过统计培养基杂菌数量和杂菌密度发现，使用了10%的次氯酸钠溶液处理后的水稻种子杂菌数量最少为0，其次是0.1%的升汞，杂菌数量为1。5%双氧水消毒效果最差，杂菌数为3，而0.1% 硫酸铜、5%高锰酸钾及70%乙醇消毒效果相当，杂菌数都为2。因此，浓度为10% 的次氯酸钠对水稻种子表面消毒效果最佳。

表1 不同化学试剂对不育系水稻种子乐3A 的表面消毒效果

2.2 不同浓度的次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒效果

同样利用传统的分离培养方法将水稻种子不同浓度梯度试验组的漂洗液涂布于NA 培养基中，每组平行重复2 次，放入数显电热培养箱中(28 ℃)培养一段时间（48～72 h），进行比较观察，若放在超净台上的NA 固体培养基和接种无菌水的NA 固体培养基没有生长菌落，说明实验试剂以及实验操作环境符合标准，实验过程中不受环境中细菌的沾染影响；若消毒后的水稻种子的NA 固体培养基没有生长菌落，说明水稻种子表面消毒完整，没有染菌。水稻种子内生菌分离前，不同浓度梯度次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒效果如表2所示，可以看出，浓度较高为5.5%和10%的次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒，时间最短，仅需15 s。而较低浓度的次氯酸钠溶液对水稻种子消毒则需要花费较长时间，次氯酸钠浓度为1.5%和2.5%时，消毒时间分别为5 min 和45 s。次氯酸钠溶液能灭杀水稻种子表面细菌，同样能杀灭其内生菌，由于活性氯含量越高，其越不利于内生菌的生长，因此需要选择的最佳的表面杀菌强度即是能完全杀灭表面细菌的最低杀菌强度的试验组。水稻种子表面杀菌强度分别是：活性氯浓度1.5%消毒5 min、2.5%消毒45 s、5.5% 消毒15 s、10% 消毒10 s。对NA固体培养基上菌落数进行统计，通过比对得出次氯酸钠溶液的最佳消毒浓度和最佳消毒时间。

表2 乐3A 稻种在次氯酸钠不同浓度和浸泡时间下的表面消毒效果

2.3 不同消毒强度的影响

由表3 可以看出：用较高浓度的次氯酸钠溶液对水稻种子进行消毒，较短时间就可以完成其表面的消毒，而且对水稻种子内生菌伤害较小。而当次氯酸钠溶液浓度较低时，需要用相对较长的时间才能完成消毒，并会杀灭部分水稻种子内生菌。从表中的数据可以得出，活性氯含量为5.5%的次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒时间为15 s 时，内生菌落数目为5，而其他三种给消毒方式内生菌落的数目分别为2、3、4。因此用5.5%的次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒时间为15 s 时对内生菌影响最小。

表3 活性氯含量不同时水稻种子表面消毒后内生菌分离效果

3 讨论

3.1 关于常见的表面消毒试剂的讨论

当前，对于植物种子的消毒方法并不是很多，且消毒效果各异。在研究水稻内生菌时，为了在达到消毒效果的同时保证植物种子活力以及内部细菌活性，主要使用化学试剂对其表面进行消毒。而对于水稻种子的表面消毒常见的化学试剂包括0.1%的升汞（氯化汞）、0.1%的硫酸铜溶液、5%的双氧水、70%的乙醇、5%的高猛酸钾溶液，10%的次氯酸钠溶液[5]，除此之外还可以用石灰水、漂白粉、402（一种抗菌剂）、强氯精（一种抗菌剂）和福尔马林等。为了保证种子在进行表面消毒后，不仅有利于种子内部内生菌的分离，还要保证不能使种子失去活性，也不能杀灭水稻种子内生细菌，保证其能完整萌发出幼芽，通常不会用到石灰水、漂白粉、402（一种抗菌剂）、强氯精（一种抗菌剂）和福尔马林。因此，在本次实验过程中没有涉及到这五种化学试剂。通过对水稻种子常见消毒试剂的比较，发现适于分离水稻种子内生细菌实验的表面消毒试剂有升汞、乙醇、次氯酸钠溶液、双氧水、硫酸铜和高猛酸钾溶液。

3.2 关于常见的几种适合水稻种子表面消毒试剂性质的讨论

低浓度高锰酸钾具有很强的氧化作用，可促使细菌或其他有机物立即放出新生态氧,通过氧化细菌体内的活性基因而发挥杀灭细菌作用[6]；过氧化氢通过复杂的化学反应解离具有高活性的羟基作用于细胞膜,其强氧化性破坏组成细菌的蛋白质,使之死亡（与高锰酸钾溶液杀菌原理相似）[7]；硫酸铜中Cu2-离子是重金属离子,病毒由蛋白质组成，蛋白质遇重金属离子会失活死亡，所以它能杀毒[8]；乙醇渗入细菌体内，让细菌的蛋白质凝固变性，它是实验室中常见的消毒杀菌剂。较高浓度的乙醇会增加蛋白质的凝固作用。当细菌接触到较高浓度的乙醇后表面就会立刻凝固成一层薄膜来阻止乙醇继续渗透，细菌不会完全失活。一些细菌一旦接触到较高浓度的乙醇，便会马上产生反应并形成有坚硬外壳的孢子来减少乙醇的伤害。在一定条件下，细菌又会重新复活。所以，乙醇浓度过高是不能用作杀菌消毒的。通常70%～75%浓度的乙醇在数秒之内就能杀灭细菌（约30 s）。用它给物体表面消毒时若结合其它药剂会提高它的消毒效果。实验选用了70%的乙醇进行第一次的水稻种子表面杀菌处理，但不能完全杀灭芽孢。

升汞毒性大，是一种重金属杀菌剂。0.1%的升汞浸泡稻种10 分钟，水稻种子表面的细菌及真菌芽孢就能有效灭杀。但经过升汞消毒的水稻种子要用无菌水数次洗涤（至少5 次），才可将残留汞洗净。又因升汞的使用会引起污染，一般消毒不提倡用升汞。次氯酸钠溶液消毒用途很广，不仅可杀菌，且没有残留、很容易分解，对人体无毒无害[8-10]。同时，次氯酸钠杀灭细菌后易于除去且没有残余，不会损伤水稻种子。结合表1 数据可以看出，在几种消毒试剂中，经过次氯酸钠消毒的水稻种子的表面没有长菌，说明通过优选法可以得出消毒效果最好的化学试剂是次氯酸钠。

3.3 关于实验环境无菌的讨论

在实际操作过程中,想要做到绝对的表面无菌很难，为了保证消毒效果的可靠性，对消毒过程必须进行严格的检查。前文检测淋洗液法、消毒水稻种子印迹法、超净工作台检测法都是为了这个目的。设置超净台无菌检测对照，是因内生细菌的分离步骤多，无菌操作时间长，操作中所用的培养基和试剂暴露在空气中的时间久，所以保证超净工作台内环境处于无菌状态很重要。

3.4 关于实验数据的讨论

比较几种化学试剂对水稻种子表面的消毒效果，经对平板表面的细菌种类和数量对比，得出水稻种子的最优消毒试剂。

从表1 中我们可以发现，未经消毒的水稻种子的表面有着大量的细菌，且种类繁多。水稻内生菌分离过程中，为了保证水稻内生细菌分离的准确性，就必须将水稻种子表面的细菌杀灭。经由升汞、乙醇、次氯酸钠溶液、双氧水、硫酸铜和高猛酸钾溶液浸泡后的水稻种子表面的细菌明显减少甚至被杀灭，说明这几种消毒试剂都有着较为良好的消毒效果，表面的大部分细菌会被灭杀，可以作为水稻种子表面消毒试剂。通过分析经过这六种消毒试剂消毒后水稻种子表面的细菌种类和细菌数量，不难发现消毒效果良好的消毒试剂就是升汞和次氯酸钠溶液了，而次氯酸钠溶液对水稻种子表面的消毒效果较升汞来说更为彻底，所有经过优选法，最终选择次氯酸钠溶液作为水稻种子表面消毒的最佳试剂。

将水稻种子分别浸泡于活性氯含量浓度梯度为1.5%、2.5%和5.5%、10%的次氯酸钠溶液中15 s、45 s、5 min、25 min，从表2 中的数据分析发现：当活性氯含量为1.5%时，浸泡稻种5 min 后能杀灭水表面细菌；当活性氯含量为2.5%时，浸泡稻种45 s便杀灭了表面的细菌；当活性氯含量为5.5%时，浸泡15 s 后即杀死了表面的细菌，通过这些数据，我们发现水稻种子经过高浓度活性氯的次氯酸钠溶液短时间处理和低浓度的次氯酸钠溶液长时间处理，都可以达到彻底消毒的效果。

从表3 的数据中我们可以发现，当活性氯含量为5.5%的次氯酸钠溶液处理水稻种子15 s 后，水稻种子内生菌落在12 个小时之内便产生了，而且菌种数量最多；当用活性氯含量为2.5%的次氯酸钠溶液处理水稻种子45 s 后，水稻种子内生菌落在36 个小时之内长出，数量较少；当用活性氯含量为1.5%的次氯酸钠溶液处理水稻5 min 后，内生菌落在48 个小时之内长出，而且菌落数量少。基于以上数据分析，我们发现5.5%次氯酸钠对水稻种子进行消毒处理15 s，既能保证水稻种子表面较为彻底的消毒，同时又能保持水稻部分内生菌活力，是本研究中最适的水稻种子消毒方法。

3.5 关于实验结果的讨论

本研究中将10%的次氯酸钠溶液稀释成四种活性氯含量不同的次氯酸钠溶液后，相比之下发现较高浓度次氯酸钠溶液对水稻种子短时间消毒效果要比低浓度较长时间消毒更好，且较大程度保证水稻种子内生菌数量种类的完整性。据此猜测，次氯酸钠溶液对水稻种子表面消毒过程中，浸泡水稻种子时间较长时，溶液会渗入水稻种子内部从而杀灭部分种子内生菌。

4 结论

相比较而言，5.5%浓度的次氯酸钠溶液对水稻种子进行约15 s 的消毒处理，不仅能达到高效的消毒效果，又能保证内生菌的活力，是几种方法中最佳的消毒方法。实验过程中的超净工作台内环境无菌检测、淋洗液无菌检测，消毒后水稻种子印迹无菌检测这几步是为了保证内生菌分离不被外界环境影响或影响最小。

基于此，设计的水稻种子表面消毒的最佳方案如下：先用无菌水淋洗水稻种子2 遍，去除稻种表面灰尘和杂质；再用70%的乙醇浸泡稻种约3 min，用无菌水洗涤1 遍，再用5.5%的次氯酸钠溶液浸泡稻种约15 s，最后用无菌水淋洗稻种，洗涤次数5～7 次。这样，就不仅能极大的确保水稻种子表面消毒的彻底性，且最大程度保证水稻及水稻内生细菌的活性。