永州地区虫生真菌资源筛查初报

周 立，张洪波，李婧婧，李泽明，李佳颖

（湖南省烟草公司永州市公司，湖南 永州 425000）

虫生真菌的广义定义是指与昆虫（同时包括螨、蜘蛛、蜈蚣等节肢动物及线虫）有各种直接关系的真菌种类。自然界中虫生真菌资源丰富，种类繁多，据不完全统计，在我国已发现虫生真菌40 属400 种以上[1-2]。虫生真菌与人类生活息息相关，主要体现在食用、药用、生防等方面。例如：冬虫夏草、蝉花等具有独特的食用和药用价值[3-4]；而白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌等在生物防治中应用较为广泛，可有效减少化学农药的使用[5]。

永州市位于湖南省南部，主要农作物有水稻、花生、甘蔗、柑橘、烤烟，危害当地农作物的害虫主要有稻飞虱、蚜虫、斜纹夜蛾、柑橘蚧虫等，给当地农作物带来巨大的经济损失。目前，作物害虫的防治主要还是依赖化学药剂。然而，在化学防治的同时，害虫快速产生的抗药性也给人类生存环境和食品安全带来极大危害。而利用虫生真菌防治农业害虫可以一定程度地减少上述危害。随着虫生真菌在害虫防治领域应用研究的不断深入，这种“新式”害虫防治策略不断被人们所认可。例如：许忠顺等[6]研究表明，环链棒束孢GZUIFR04XS8 对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）蛹和幼虫有较好的防治潜力；周建云等[7]研究发现，白僵菌Bb062 菌株对烟青虫（Helicoverpa assulta）3龄幼虫有较高的毒力。

为了全面了解我国虫生真菌的种质资源，研究人员在全国各地对虫生真菌的多样性展开调查。王军等[8]对秦巴山区虫生真菌种类进行调查，共分离出9目13 科22 属，优势目为丛梗孢目（Moniliales）。周家喜等[9]调查了尧人山国家森林公园的虫生真菌资源，共培养出3 科7 属10 种，其中白僵菌属为优势属。虫生真菌的种类丰富度及数量受到昆虫活动、地面覆盖物及环境中人类活动程度等众多因素的影响，且各因素之间有着相互关联，部分真菌只在特定的自然环境下表现为虫生真菌[10-11]。同时有研究表明，虫生真菌与当地的土壤真菌关系密切[12-14]。为了尽可能地收集潜在的虫生真菌，虫害高发区的土壤真菌引起了学者们的关注。与外地引入的虫生真菌菌种相比，当地采集的虫生真菌菌种与害虫物种的生态兼容性（湿度、温度、紫外吸收能力等）更好，并能降低对非目标生物的风险[15]，因此在主要害虫发生区收集并筛选当地土壤真菌中的虫生真菌种质资源具有重要意义。笔者调查了永州地区的虫生真菌资源，填补了湖南省永州市虫生真菌资源库的空白，也为后续筛选害虫高致病力菌株奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 虫生真菌土壤样品采集2018—2019 年，在永州市范围内采集土样，根据不同地区自然地理区划、生态区划、气候、地表植被等因素，选择有虫害的田块及周边不同生境和土壤较肥沃的位置作为采样点。采集土样时去掉表层土，取土表以下深5～10 cm 处的土壤200 g 左右，放入样品袋中，在样品袋标签上标明编号、地点、时间、海拔高度等信息，于4℃保存等待处理。共采集土壤标样427 份。

1.1.2 供试虫源斜纹夜蛾虫卵（科云生物有限公司）采用人工饲料饲养于生物防治教育部工程研究中心的RXZ-500C 型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）进行继代繁殖，形成斜纹夜种群。饲养条件为温度（27±1）℃，光周期 L ∶D =14 ∶10，相对湿度（75±5）%。选取斜纹夜蛾2 龄幼虫进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤中真菌的分离与纯化将土壤样品过筛去掉石粒和杂物，取净土10 g 悬浮于90 mL 0.1%的吐温-80 溶液中摇匀，静置15 min，取上清液2 mL 稀释于8 mL 0.1%吐温-80 中，配制成土壤悬浮液。再将土壤悬浮液稀释10 倍。取0.5 mL 土壤悬浮液和稀释液分别接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，各重复4 次，用涂布棒涂抹均匀，25℃培养3～7 d，然后用接种环挑取单菌落，接种于PDA 板上继续培养，如有污染继续挑选纯化，直至培养基中长出单一菌落。

1.2.2 菌株形态特征及产孢结构观察将菌株接种于PDA 平板上，在（25±0.5）℃恒温培养箱中培养7～10 d，待培养成熟，制作产孢结构标本，观测菌落形态特征（正面和背面的颜色、质地、大小、高度、表面、边缘等），并拍照记录。

1.2.3 菌株的分子生物学鉴定选择Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司] 进行真菌总DNA 提取，以通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、ITS5（5′-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）进行菌株的ITS 区扩增，扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35 个循环；72℃延伸10 min。取5 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物情况。将阳性样品送往上海美吉生物医药科技有限公司测序，再利用Genious 7.1.4 软件进行序列拼接，然后在NCBI 中采用BLAST 工具进行同源相似性搜索，采用MEGA 7.0 软件构建系统进化树。

1.2.4 孢子悬浮液的配制取培养10～14 d 分离纯化的菌株在超净工作台内加入含0.1%吐温-80 的蒸馏水刮除菌落，洗出平皿内的孢子，转移到灭菌的三角瓶中，使用恒温磁力搅拌器中速搅拌20 min，使其均匀分散，配制成母液。按照10 倍稀释法将菌液稀释100 倍，显微镜下用血球计数板计数分生孢子数，5次重复。然后将分生孢子浓度稀释至1×108CFU/mL备用。

1.2.5 菌株致病力测试将鉴定后的菌种分别培养制成孢浊液，采用浸蘸法用毛笔将幼虫挑入浓度为1×108CFU/mL 的孢子悬浮液中浸泡约5 s，然后转移至含饲料的培养皿中观察。用已灭菌的0.1%吐温-80作对照，每个处理20 头幼虫，3 次重复。完成接种后，所有培养皿（直径为12 cm）用保鲜膜封口并刺孔通气后置于生化培养箱中饲养，连续7 d 逐日定时观察记录，并及时将虫尸移出，虫尸置于26℃下保湿培养且根据斜纹夜蛾2 龄幼虫尸体体表长出物特征确认有效致死，感病的虫尸即为僵虫。

1.3 数据统计与分析

死亡率（%）=（试虫死亡数/试虫数）×100

校正死亡率（%）=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100

利用SPSS 21.0 软件进行试验数据分析，采用单因素方差分析对斜纹夜蛾2 龄幼虫死亡率进行处理，并运用Tukey 检验差异显著性，用GraphPad Prism 8绘制图表。

2 结果与分析

2.1 土壤样品中真菌的分离纯化

使用选择性培养基对永州市6 个县采集烟田的土壤标样进行真菌分离、纯化，得到66 株菌株，其中宁远县、新田县、蓝山县、江永县、江华县、道县分别分离得到菌株10、17、15、4、8、12 株，编号后保藏于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心，为进一步菌株鉴定做准备。

2.2 菌落形态及孢子结构分析

对分离纯化的菌株进行菌落形态及孢子结构的观察，依照特征，这66 株菌株大致可分为白僵菌属、虫草属、绿僵菌属、青霉属、拟青霉属、篮状菌属6 类。具体特征描述如下。

图1 中，A、B 所示菌落粉状、绒状或茸毛状，表面白色、乳白色或淡黄色；G、H 所示菌丝细长透明有隔，产孢细胞形状不定，瓶状或丝状，垂直着生在主轴菌丝上或短的分支上，形成一个球形的产孢细胞束，分生孢子为球形或卵形，孢子着生于产孢细胞顶部延伸而成的之字形丝状结构上，均为白僵菌属典型的形态特征； C、D 所示菌落平展，菌丝薄，表面有细颗粒结构，白色，菌落不规则形，边缘呈树状分枝，背面中部褚石色，向外逐渐变淡；I、J 所示菌丝分隔，透明，光滑，分生孢子透明，光滑，长梭形或近柱状，排列成长链状，为虫草属典型形态特征；E、F 所示菌落呈灰橄榄色，整体较薄，平坦，边缘整齐，质地绒状，无渗出液，无可溶性色素，菌落背面呈淡黄色；K、L 所示分生孢子梗产生于表面菌丝，壁光滑，帚状枝为双轮生、单轮生兼不规则生，分生孢子近球形至椭球形，壁粗糙，均为篮状菌属形态特征；M、N 所示菌落质地绒状，蓝绿色，边缘菌丝体白色，有些许浅黄色渗出液和可溶性色素，菌落反面呈浅黄褐色，分生孢子球形、近球形、椭圆形或近椭圆形；S、T 所示孢梗茎较细，壁薄，常具有隔膜，部分菌株孢梗茎顶端呈现不同程度膨大，是青霉属的典型特征；O、P 所示菌落呈白色、粉红色或紫色，菌丝无色或紫色，粗糙或光滑，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，可有几级轮状分枝；U、V 所示瓶梗基部柱状或膨大，向上变成细长颈部，分生孢子单胞或偶有双细胞，光滑或粗糙，无色、紫色或绿色，形成离散的分生孢子链，是拟青霉属的典型形态特征；Q、R 所示菌落最初为白色，进入产孢阶段后菌落中间可见不同程度的绿色分生孢子堆，分生孢子梗单生或者聚集形成分生孢子梗座，排列紧密，呈帚状分枝状或轮生体状；W 所示分生孢子呈长形至长椭圆形，无色，通过粘液连接形成平行排列的淡绿至橄榄绿柱状孢子链，是绿僵菌属典型形态特征。

2.3 菌株的分子生物学鉴定

将供试菌株所扩增的ITS4、ITS5基因片段，通过Genious 7.1.4 软件进行拼接，在NCBI 上采用BLAST 工具进行同源相似性搜索，在已发布序列中下载同源性高的序列，将已拼接序列和下载的同源序列进行多序列比对，使用MAGA-X 中最大似然法构建Maximum Likelihood Tree（M-L 树），如图2 所示，66 株真菌共聚为7 大类，分别为刺束梗孢属、白僵菌属、虫草属、绿僵菌属、青霉属、拟青霉属、篮状菌属。其中，菌株SCAULS28 与金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）聚为一枝，支持率为100%；菌株SCAUXT10、SCAUXT20、SCAUXT24、SCAUJY18、SCAUDX11、SCAUDX32 与淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）聚为一枝，支持率为97%；SCAUJH16、SCAULS26 聚为一枝，支持率98%；菌株SCAULS22 与Akanthomyces attenuatus，SCAULS3、SCAULS27、SCAULS37、SCAUXT6、SCAUXT9、SCAUXT22、SCAUXT29、SCAUJY27、SCAUJY39、SCAUJH7、SCAUNY27 与虫草爪哇（Cordyceps javanica）聚为一枝，支持率为100%；菌株SCAULS1、SCAULS17、SCAULS30、SCAULS112、SCAULS222、SCAUXT15、SCAUJH19、SCAUDX37、SCAUNY28、SCAUXT16 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）聚为一枝，支持率为100%；菌株SCAULS11、SCAULS38、SCAUXT11、SCAUXT25、SCAUJH36、SCAUDX2、SCAUDX38、SCAUDX19、SCAUDX32 与篮状菌属聚为一枝，支持率为100%；菌株SCAULS4、SCAUXT7、SCAUXT23、SCAUXT26、SCAUXT27、SCAUXT28、SCAUXT32、SCAUJY2、SCAUJH1、SCAUJH12、SCAUJH15、SCAUJH17、SCAUDX30、SCAUDX33、SCAUDX34、SCAUDX35、SCAUDX36、SCAUNY3、SCAUNY4、SCAUNY5、SCAUNY6、SCAUNY8、SCAUNY23、SCAUNY24、SCAUNY25、SCAULS29、SCAUDX1 与青霉属聚为一枝，支持率为70%。由表1 可知，篮状菌属中包括柄篮状菌（Talaromyces stipitatus）、马尔尼菲蓝状菌（Talaromyces marneffei）、Talaromyces purpureogenus、Talaromyces verruculosus、Talaromyces pinophilus、Talaromyces oumae-annae；青霉属中包括波兰青霉（Penicillium polonicum）、Penicillium janthinellum、Penicillium sumatraense、橘青霉（Penicillium citrinum）、Penicillium brocae。

图2 系统发育树

2.4 菌株对斜纹夜蛾的致病力测定

如表2 所示，相同处理浓度，66 株虫生真菌的致病力存在差异，当孢子悬浮液浓度为1×108CFU/mL时，处理第7 天各菌株引起的校正致死率在0～71.71%之间。与对照组相比，SCAUYZ16、SCAUJH19、SCAUXT15、SCAULS1、SCAULS112、 SCAULS17、SCAUDX37和SCAUNY28 等菌株的校正致死率表现出显著差异（P＜0.05），其中菌株SCAUYZ16、SCAUJH19、SCAUXT15的校正致死率达50%以上，菌株SCAUYZ16 的校正致死率最高，为70.71%，其次是SCAUJH19，为57.84%。而菌株SCAULS30 等剩余菌株的校正致死率均低于17.31%，部分菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死率微弱，未表1 中列出。SCAUYZ16、SCAUJH19、

表1 供试菌株分类鉴定结果

表2 供试菌株（1×108 个/mL）孢子悬浮液对斜纹夜蛾二龄幼虫的第7 d 致死率

SCAUXT15、SCAULS1、SCAULS112、 SCAULS17、SCAUDX37 和SCAUNY28 等菌株对斜纹夜蛾2 龄幼虫的侵染阶段如图3 所示。

图3 斜纹夜蛾幼虫感病状

3 结论与讨论

在永州农业主产区采集土样进行真菌分离纯化，共获得66 株菌株，依据《中国真菌志》[16-17]《真菌鉴定手册》[18]等相关资料对所分离纯化后的菌株进行形态观察，并对66 株真菌菌株的ITS基因片段进行扩增，经过测序及比对分析，用最大似然法联合构建了系统发育树。综合形态观察和分子生物学的鉴定结果显示，所获得的66 株菌株可分类为7 属12 种，分别为刺束梗孢属的A.attenuatus，白僵菌属的球孢白僵菌，虫草属的虫草爪哇，绿僵菌属的金龟子绿僵菌，青霉属的波兰青霉、橘青霉，拟青霉属的淡紫紫孢菌，篮状菌属的柄篮状菌、马尔尼菲蓝状菌、T.verruculosus、T.pinophilus、T.oumae-annae。

另外，研究结果显示，永州地区土壤中分离到的球孢白僵菌菌株在斜纹夜蛾防治中有很高的应用潜力。该研究中，8 株球孢白僵菌菌株对斜纹夜蛾具备寄生性和致死性，用孢子悬浮液1.0×108CFU/mL 处理的第7 天，斜纹夜蛾2 龄幼虫的校正死亡率为17.31%～70.71%；这与前人的研究结果相符。郭亚力等[19]研究球孢白僵菌MZ050724 菌株对斜纹夜蛾2 龄幼虫的侵染效果，在3.0×108CFU/mL 孢子悬浮液中处理7 d后，斜纹夜蛾校正死亡率为68.18%；袁盛勇等[20]研究了球孢白僵菌 MZ041016 菌株对斜纹夜蛾4 龄幼虫的侵染效果，在4.5 ×108CFU/mL 孢子悬浮液中处理8 d 后，斜纹夜蛾最高校正死亡率为85.87 %。以上结果表明从永州地区土壤中分离到的球孢白僵菌对斜纹夜蛾2 龄幼虫有一定防治潜力，并且同种菌种的不同菌株有不同的致病效果。

该研究仅针对永州地区的斜纹夜蛾进行了菌株致病力检测，尚未对其他害虫进行致病力测试，暗示该菌株库仍有潜在的有效菌株资源等待挖掘。通过此次对永州地区虫生真菌资源的调查研究，既初步创建了该产地虫生真菌资源库，也为当地的害虫生物防治奠定了基础。