苔干和竹笋提取物及其复配物的抗菌活性研究

陈志轩，华 奕，陈学红，文 浩，孙会刚

（徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏徐州 221018）

植物中抑菌物质种类研究和应用是当代研究热点之一，许多专家和学者对植物的抑菌效果进行了大量研究，发现具有有效抑菌活性的植物可达1 400种[1-2]。其中，具有一定抑菌作用效果的次级代谢产物已经达到了40多万种，这些次级代谢产物大致可分为黄酮类、生物碱类、多炔族类、有机酸类、酚类、甙族、木脂素和香豆素等[3]。

苔干有很高的营养和保健价值。张雪香等[4]分析测定了苔干中含有大量糖类、酚类、生物碱及黄酮类物质。甄清等[5]对苔干抗菌作用进行了实验研究，得出苔干85 ℃的醇提取液具有抑菌性质，结果分析苔干的醇提取液中含黄酮类物质。甄清等[6]利用苔干的丙酮、乙酸乙酯提取液进行抑菌实验，发现苔干提取液对短帚霉菌、犬小孢子菌等各类菌种都可能具有一定的抑制效果，竹笋也具有良好的抑菌作用。高雪娟等[7]用竹笋壳提取物进行抑菌试验，结果表明，提取物对于根霉、黑曲霉、酿酒酵母这3种天然真菌没有明显的抑制作用，但是对于大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草黄芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌等菌种具有显著的抑制效果。彭昕等[8]对雷竹笋总甾醇和总黄酮的抑菌活性进行了研究，发现雷竹笋有机溶剂提取物对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等都具有良好的抑制作用，其对细菌抑制效果大于真菌，对革兰氏阳性菌抑制效果大于革兰氏阴性菌，并且总黄酮的抑菌效果通常比总甾醇的抑菌效果要更好。本文对提取温度、提取时间、乙醇浓度和复配比例等一系列参数进行单因素抑菌实验，探究苔干和竹笋的乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物

苔干，购于安徽亳州；竹笋，购于四川乐山。

1.1.2 培养基

LB固体培养基：蒸馏水400 mL，琼脂8 g，氯化钠（NaCl）4 g，酵母提取物2 g，胰蛋白胨4 g，pH为7.4～7.6。肉汤琼脂固体培养基：蒸馏水400 mL，琼脂7.2 g，氯化钠（NaCl）6 g，胰蛋白胨4 g，牛肉膏6 g。葡萄糖琼脂培养基：蒸馏水400 mL，琼脂8 g，氯化钠（NaCl）2 g，胰蛋白胨6 g，葡萄糖8 g，牛肉膏0.2 g。

1.1.3 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），徐州工程学院；蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），徐州工程学院；大肠杆菌（Escherichia coli），徐州工程学院；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），徐州工程学院。

1.2 仪器与设备

FA2140N电子天平，上海精密科学仪器；YP402N电子天平，上海精密科学仪器；立式高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology；循环水真空泵，上海启前电子科技；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台，苏州净化设备；KQ5200DE型数控超声波清洗机，昆山市超声仪器；烘箱，上海群基实验仪器技术；GS-700高速多功能粉碎机，永康市天祺盛世工贸；BCD-539WT电冰箱，青岛海尔；BCD-212KA电冰箱，青岛海尔；恒温恒湿箱，上海新苗医疗机械。

1.3 实验方法

1.3.1 提取液的制备

以乙醇为溶剂，用超声波辅助提取法[9]提取。精确称量总量10 g的苔干与竹笋粉末，分别按不同质量比（7∶3、5∶5、3∶7）混合置于烧瓶中，分别倒入100 mL 50%的乙醇溶液，搅拌。调整超声波清洗机参数至55 ℃、60 min。室温静置、抽滤浓缩，旋蒸至10 mL，制成1 g/mL的原液备用。

1.3.2 抑菌实验

将4种菌液分别稀释至10-3与10-4两个梯度待用。用移液枪分别吸取100 μL的10-3和10-4两个梯度菌液于合适的培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀并做好标记。采用打孔法[10]在培养基上打好孔，将提取出来的抗菌活性物质注射适量到孔内。盖上盖子，将平板置于36.8 ℃的恒温恒湿箱中，培养17 h后用游标卡尺测定抑菌圈大小。

1.3.3 单因素实验

在提取过程中影响苔干和竹笋提取抗菌活性物质的主要参数有4个：复配比例、提取时间、提取温度以及乙醇浓度。本实验对每项参数进行3个水平的单因素实验，提取时间：30 min、60 min、90 min；提取温度：45 ℃、55 ℃、65 ℃；乙醇浓度：30%、50%、70%，并 分别用7∶3、5∶5、3∶7这3个复配比例来对每个参数进行重新提取，再测量其抑菌圈大小。每种方法测定两种（10-3和10-4）菌液浓度。

2 结果与分析

2.1 抑菌实验

当乙醇浓度为50%、提取温度为55 ℃、提取时间为60 min时，苔干与竹笋的提取液及其复配液对10-3与10-4两浓度的4种菌均有不同程度抑制效果。实验结果如图1所示。

图1 提取液抑菌效果

2.2 不同提取条件的抑菌效果

通过实验发现4种指示菌的实验结果一致，以大肠杆菌为例得出的最佳提取条件，如表1和表2所示（表中数据为3次重复实验平均值）。综合实验结果，提取时间为60 min，乙醇浓度为50%时，提取温度65 ℃效果最好，在上述最优提取条件下，7∶3这个复配比例效果最好。

表1 不同提取条件对大肠杆菌的抑菌效果

表2 最优条件下不同复配比例对大肠杆菌的抑菌效果

2.3 复配比例对不同微生物的抑菌效果

由表3可知，在最优提取条件下（提取时间60 min、提取温度65 ℃、乙醇浓度50%），苔干占比越高，抑菌效果越好，即最佳复配比均为7∶3。

表3 复配比例对不同微生物的抑菌效果（单位：mm）

3 结论

本研究以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蜡样芽孢杆菌为指示菌，通过一系列单因素抑菌实验得到，乙醇作为提取溶剂时，苔干芦笋最佳提取条件为提取时间60 min、提取温度65 ℃以及乙醇浓度50%。在此条件下又进一步以复配比为变量，发现苔干竹笋复配比为7∶3时对4种菌抑制效果最好。