内膜转运蛋白编码基因PEG-344在肺炎克雷伯菌毒力鉴别中的应用

范沁榕，杨 笑，胡仁静，2

(1. 南通大学附属无锡市第二人民医院检验科，江苏 无锡 214002； 2. 青海省海东市平安区中医医院检验科，青海 海东 810699)

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, HvKP)是肺炎克雷伯菌的高毒力变种，可引起肺炎合并肝脓肿、脑膜炎和眼内炎，具有强侵袭性和预后差等特点[1]。HvKP在世界范围内感染率呈持续上升趋势，及时高效地将临床分离的HvKP与经典低毒肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKp)进行鉴别诊断显得尤为重要，早期鉴别可降低HvKP造成的致残率及病死率，为临床感染控制和流行病学调研提供细菌学证据[2]。目前毒力筛查比较公认的金标准是小鼠毒力模型[3]，基层实验室很难进行检测。大蜡螟毒力模型因其可操作性强，准确性高，近年来得到广泛应用。快速毒力基因检测因时间短、可操作性强，临床应用越来越广泛，目前比较常用的毒力基因有prmpA、prmpA2、iucA、iroN、fimH等[4]。PEG-344位于质粒上，编码内膜转运蛋白，其产物是代谢物转运子超家族中的一种渗透酶。Bulger等[5]对菌株hvKP1(GenBank no. AOIZ00000000)通过体外腹腔积液、LB培养基培养，小鼠感染模型等试验发现，PEG-344是hvKP1造成小鼠肺部感染时不可或缺的毒力因素。2017年后逐渐出现有关该标志物的报道，但是在血流感染标本鉴别方面研究较少。本研究评估PEG-344对无锡地区血流感染中肺炎克雷伯菌毒力预测的价值。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集2020年1月—2021年12月南通大学附属无锡市第二人民医院血流感染患者血标本中分离的肺炎克雷伯菌，采用法国梅里埃全自动快速微生物质谱检测系统(VITEK MS)进行鉴定。

1.2 黏液丝试验 用接种环轻柔蘸取哥伦比亚血琼脂平板上的单克隆菌落，若黏液丝长度>5 mm时，判定为黏液丝试验阳性。

1.3 大蜡螟毒力检测试验[6]采用大蜡螟毒力试验结果作为金标准进行分组，将菌株分为高毒力组和经典组。本试验选取重约250 mg的大蜡螟幼虫，幼虫购自天津惠裕德生物科技公司，试验前剔除活动力欠佳或有灰黑色斑点的虫体。倍比稀释配制菌液，设菌液浓度从高到底分别为107、106、105......102CFU/mL的6个试验组，第7组为注射磷酸盐缓冲液(PBS)对照组，第8组设置为空白对照组(对虫体不做任何处理)。使用20.0 μL微量注射器从幼虫右侧的第一腹节进行注射，将大蜡螟放置37℃培养箱中进行孵育，每24 h观察幼虫存活量并记录，观察至144 h，绘制生存曲线，计算144 h的lgLD80，同一浓度需重复3次。试验结束后大蜡螟做灭菌无害化处理。

1.4 wzi基因测序进行荚膜血清型检测[7]采用水煮法提取菌株DNA，PCR反应采用25 μL体系，包括上下游引物各1.0 μL，mix 12.5 μL，无taq酶水8.5 μL，DNA模板2 μL。扩增产物进行测序，比对获得wzi对应的型。

1.5 毒力标志物的检测 本研究选用位于毒力质粒上的五种毒力基因prmpA(荚膜黏液表型调节基因)、prmpA2(荚膜黏液表型调节基因)、PEG-344 (内膜转运蛋白编码基因) 、PEG-1631(保守假定蛋白)、PEG-589(氨基葡萄糖内酯脱碳酶家族调节基因)，具体引物序列见表1。

表1 毒力标志物的引物序列表

1.6 统计学方法 应用Graphpad 6.0软件进行数据的处理与分析，并绘制生存曲线图。应用SPSS 22.0进行144 h LD80和lgLD80计算，采用Shapiro-Wilk检验对lgLD80进行正态分布的检验，非正态分布数据采用M(P25，P75)方式表示，采用Kruskal-WallisH检验进行多组间比较，Mann-WhitneyU检验进行两组间比较。采用卡方检验进行诊断指标分析，具体包括：特异度、灵敏度、优势比等；若四格表中出现0，计算优势比的时候将每格子的频数增加0.5。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株来源 共收集血流感染患者血标本分离的肺炎克雷伯菌36株。科室分布：肝胆外科6株，重症监护科8株，肾内科6株，血液科6株，呼吸科4株，其他科室共6株。

2.2 wzi荚膜血清型结果 通过wzi 测序，并将wzi型与K/KL型进行匹配。36株菌血清型检出情况如下：wzi-1-K1型占16.67%(6株)，wzi-57-K57型占11.11%(4株)，wzi-64-KL64型占8.33%(3株)，wzi-2-K2/30型占5.56% (2株)，wzi-50型占5.56%(2株)；其他型包括：wzi(4、5、16、18、20、60、63、72、81、100、101、115、130、170、173、187、322、325、350)各1株。目前公认的高毒力血清型wzi-1-K1、wzi-57-K57、wzi-4-K2、wzi-2-K2/30、wzi-5-K5、wzi-20-K20、wzi-16-K16均有检出，总检出率为44.44%。见表2。

表2 36株菌株wzi等位基因和对应K/KL型分布

2.3 大蜡螟毒力试验结果 观察大蜡螟144 h的生存率，绘制幼虫的生存曲线，计算LD80和lgLD80。大蜡螟毒力试验显示在浓度为102～107CFU/mL时，不同的菌株对大蜡螟幼虫的致死率呈现浓度依赖性。根据菌株LD80并结合血清型判别菌株毒力，LD80<106CFU/mL为高毒力组，LD80≥106CFU/mL为经典组。高毒力组包含16株菌，15株为常见高毒力血清型(wzi-1、wzi-57、wzi-4、wzi-2、wzi-5、wzi-20、wzi-16)的LD80为102～105CFU/mL；1株wxwh02(wzi-64)的LD80为103～104CFU/mL，该菌分离自侵袭性眼内炎合并败血症患者，毒力显著高于其他2株同型菌。20株经典组非高毒力血清型的LD80为106～107CFU/mL；其中wxwh 30(wzi-2)的LD80为106～107CFU/mL。Shapiro-Wilk检验显示高毒力组和经典组lgLD80为非正态分布的数据，W值分别为0.879、0.633，P<0.05；采用非参数检验进行多组和两组之间的比较，高毒力组lgLD80低于经典组(Z=-0.914，P<0.01)；根据wzi血清型，采用Kruskal-Wallis检验进行多组之间比较，各组之间差异有统计学意义(H=91.08，P<0.01)。见表3。部分菌株生存曲线见图1，包括高毒力组wxwh01(wzi-1)、wxwh08(wzi-2)、wxwh11(wzi-5)、wxwh15(wzi-20)、wxwh18(wzi-57)、wxwh02(wzi-64)；经典组：wxwh25(wzi-50)、wxwh35(wzi-64)。

表3 两组wzi血清型144 h LD80和lgLD80的结果

2.4 黏液丝试验结果评价 36株菌株中高毒力组的菌株黏液丝试验阳性率为87.50%(14/16)，经典组有3株菌落非常黏稠，用接种环极不容易挑起，黏液丝试验虽然为阳性但是不能判定为高毒力菌株，经典组阳性率为15.00%(3/20)。

2.5 毒力基因检测结果 基于临床诊断及大蜡螟毒力试验进行分组，分别检测prmpA、prmpA2、PEG-344 、PEG-1631、PEG-589毒力基因的PCR结果，同时结合黏液丝试验对鉴别能力进行综合评价。结果显示：毒力基因中，PEG-344检测的灵敏度、特异度优势比最高，除wzi-2(wxwh30)假阳性以外，其余结果与毒力试验完全一致，PEG-1631、PEG-589检测效能略低于PEG-344。目前应用最多的prmpA、prmpA2在5个检测指标中的检测效能最低。黏液丝试验的检测效能低，尤其是对于经典组的菌株，易造成假阳性。见表4。

表4 各类生物指标鉴别毒力的效能

3 讨论

近年来，耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(CR-HvKP)引起的感染不断增多，我国出现的CR-HvKP主要由碳青霉烯类耐药的ST11型肺炎克雷伯菌获得毒力质粒演变而来[8]，高毒力合并高耐药的CR-HvKP成为新一代的“超级细菌”，给临床带来极大的挑战[9]。精准完成毒力的鉴别对于临床治疗及流行病学研究极为重要。

本次研究选取2020—2021年从血流感染患者中分离的36株肺炎克雷伯菌，相较于临床痰和尿标本，血标本中检出病原体为定植菌的可能性更低；且肺炎克雷伯菌血流感染患者的病死率相对较高。该高毒力生物标志物PEG-344能够快速筛查出高毒力的肺炎克雷伯菌，灵敏度为100%，特异度为95%，可为临床及时调整用药提供依据。

本课题组在2018年已完成肺炎克雷伯菌大蜡螟毒力模型的建立[6]，虽然微生物学者对大蜡螟模型的认可程度不一致，但是目前对基层实验室而言，小鼠或兔的动物试验很难开展，大蜡螟的操作相对简便且成本低。虽然大蜡螟试验也存在重复性低、暂无标准化操作流程的缺点，但是该试验仍为毒力试验的重要参考模型。本课题组的经验如下：①重复三次试验；②对幼虫虫体的体重选择的一致性；③接种者的手法，左手食指和大拇指轻捏虫体，右手单手接种。

黏液丝试验用于鉴定HvKP的可靠性存在争议。本研究中在黏液丝试验的灵敏度为87.50%，特异度为15.00%，低毒力的经典组也存在黏液丝阳性的菌株，易造成假阳性的结论，从而造成HvKP的过度判读，尤其是对于呼吸道标本假阳性的判读，造成HvKP阳性率虚高。文献[10]表明，无菌体液标本检测中，肺炎克雷伯菌的黏液丝试验被提议作为HvKP的一种筛查方法。

本研究选择5种毒力标志物进行毒力鉴定效能的评判，PEG-344的检测效能最高，其次是PEG1631、PEG589、prmpA、prmpA2。PEG-344是位于质粒上的编码内膜转运蛋白，对菌株hvKP1小鼠感染模型等试验发现，PEG-344与hvKP1造成小鼠肺部感染相关，但是与皮下感染无关。hvKP1的基因登录号为AOIZ00000000，菌株hvKP1是2013年分离自1例24岁肝脾脓肿的越南男性患者的脓液标本，完成全基因组测序[11]。Hu等[12]发现65株HvKP PEG-344检测的灵敏度为96.9%。Liao等[13]发现PEG-344的诊断灵敏度为99%、特异度为96%，准确性为97%，为检测效能最高的指标。对PEG-344深入研究发现PEG-344与基因pagO具有同源性[14]，pagO存在于hvKP1的毒力质粒上，已被命名为PEG-1860。PEG-1860(pagO)与PEG-344的相似性为81.6%，同源性为67.3%。PEG-344和PEG-1860都存在于hvKP1毒力质粒上，而且这两个基因似乎都参与了运输。

prmpA、prmpA2则是位于质粒上调控荚膜多糖表达的毒力基因[2]，prmpA、prmpA2的缺失将降低荚膜的产量和毒力，为目前广泛应用于肺炎克雷伯菌毒力筛查的基因指标。prmpA、prmpA2评价毒力效能相对理想，杨朋等[15]进行HvKP的分子标志物研究发现，iucA的灵敏度(90.9%)和特异度(97.7%)最高，其次为prmpA2(分别为83.6%、100.0%)。Lee等[16]研究发现，在kpn-CG43中，prmpA和prmpA2都促进了荚膜的产生，但kpn-NTUH-K2044 中仅prmpA促进了荚膜的生成。prmpA、prmpA2之间的关联需进一步深入研究。

本次研究发现高毒力组菌株wxwh02血清型为wzi-64-KL64(K64)，K64是我国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的主要血清型[17]，wxwh02分离自1例肝脓肿合并眼内炎、败血症的患者，患者出现侵袭性感染，结合大蜡螟毒力试验确认为高毒力菌株，进一步进行黏液丝试验、prmpA、prmpA2、PEG-344均为阳性，数据已发表[18]。经典组中wxwh 30的血清型为wzi-2，是常见的高毒力血清型。wxwh02和wxwh30 的wzi 结果表明，仅通过荚膜血清分型不足以鉴定HvKP菌株。在耐药和毒力的质粒极容易传播的现状下，近年来出现了同时具有多重耐药和高毒力两种表型的肺炎克雷伯菌，非高毒力血清型的菌株也渐渐呈现高毒力的表现，因此，不可单凭血清型进行菌株毒力高低的判定，临床需要引起重视。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌与HvKP在2015年之前为两大独立的致病模式，2015年之后耐药的肺炎克雷伯菌ST11-K64获得毒力质粒形成超级细菌[19]。Jia等[20]对中国24所医院2018年血流感染患者分离的239株肺炎克雷伯菌进行检测，22.59%(54株)为HvKP，本研究分离自血流感染患者血标本的肺炎克雷伯菌中44.44%为HvKP，可见本地区血流感染患者的HvKP占比较高，因此，进行HvKP的感染防控尤为重要。对于临床分离的肺炎克雷伯菌，尤其是社区感染、肝脓肿患者、具备远处播散能力的菌株应尽早鉴别毒力、尽早治疗、尽早完成环境的消毒，阻断质粒的传播路径，减缓超级细菌蔓延的速度。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。