生物絮凝剂改性菌丝球负载好氧反硝化菌T13强化脱氮

孔祥震　郭海娟　马放　耿明月　肖霄

摘要：由黑曲霉Y3（Aspergillus niger Y3）形成的菌丝球经过生物絮凝剂改性强化后作為生物载体固定好氧反硝化菌T13 （Pseudomonas sp. T13），对其固定前后对全氮的去除效能、菌群的活性进行研究并分析固定化对于生物强化脱氮效果的影响。结果表明，菌丝球负载T13后去除全氮效能得到了明显的提高。当改性菌丝球（湿质量）与T13菌液（3.5×108CFU/ml）的质量体积比 为1∶15时，去除全氮的效能最好。改性菌丝球负载T13后的表观图像和电镜扫描图像（SEM）显示，T13细菌附着在改性菌丝球的表面，且改性菌丝球载体的结构可以连续培养45 d后仍保持紧实结构。傅里叶红外光谱（FTIR）和三维荧光光谱（EEM）结果显示，胞外聚合物（EPS）在改性菌丝球固定T13的过程中起到了关键作用。菌丝球的菌丝缠绕形成的结构提供了强有力的机械结构，且具有较大的比表面积和良好的传质性能，改性菌丝球可以作为良好的生物载体用于生物强化。

关键词：改性菌丝球;强化脱氮;好氧反硝化菌;生物载体

中图分类号：X52文献标识码：A文章编号：1000-4440（2022）02-0377-10

Enhanced nitrogen removal by bioflocculant combined mycelial pellets loaded with aerobic denitrificans T13

KONG Xiang-zhen GUO Hai-juan MA Fang GENG Ming-yue XIAO Xiao

Abstract：After modifying and strengthening of mycelial pellets formed of Aspergillus niger Y3 by bioflocculant， the mycelial pellets were used as bio-carriers to immobilize aerobic denitrifying bacterium T13 （Pseudomonas sp. T13）. Removing capabilities of total nitrogen （TN） and microflora activities of mycelial pellets before and after immobilizing of Pseudomonas sp. T13 were studied， and the influence of immobilization on the denitrification effect strengthened by biological factors was analyzed. The results showed that， the removal efficiency of mycelial pellets in removing TN was effectively improved after immobilizing of Pseudomonas sp. T13. The mycelial pellets showed the best effect in TN removing when the mass-volume ratio of modified mycelial pellets （wet weight） to T13 bacterial suspension （3.5×108 CFU/ml） was 1∶15. Photograph and scanning electron microscope （SEM） images of modified mycelial pellets after immobilizing of Pseudomonas sp. T13 revealed that， the T13 bacteria attached on the surface of mycelial pellets， and the structure of modified mycelial pellets maintained firm and intact after continuous cultivation for 45 days. Results of Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） and three-dimensional excitation-emission matrix （EEM） suggested that， extracellular polymer substances （EPS） played an important role in the process of immobilization of T13 by modified mycelial pellets. The structures formed by entangling structure of mycelial pellets provided strong mechanic structure， and had large specific surface area and fine mass transfer performance. Modified mycelial pellets can be used as good bio-carrier for biomass immobilization.

Key words：modified mycelial pellets;enhanced nitrogen removal;aerobic denitrifying bacterium;biomass carrier

江苏农业学报2022年第38卷第2期

孔祥震等：生物絮凝剂改性菌丝球负载好氧反硝化菌T13强化脱氮

生物强化技术在污水处理技术应用的过程中具有独特的优势，如缩短生化系统的启动周期、提高污染物的去除效率、减少剩余污泥产量等[1]。生物强化脱氮也是污水处理提标改造过程中一项重要的生物强化技术，且研究者已经在国内外进行了较为广泛的研究。生物强化脱氮技术在污水处理系统中利用具有特定脱氮功能微生物的特性，投加功能性微生物菌剂，增加其生物量并提高其功能性活性，加上调整工艺运行手段来达到改善脱氮效能的目的，提高了氮素的脱除效果，从而促进出水水质的达标排放[2]。但是在投加功能性生物菌剂时，仍会面临功能性菌种流失的问题，导致系统强化不够理想。

在生物强化技术应用的过程中，投加合适的载体使功能性微生物附着其上，得以繁殖并维持其活性是解决菌种流失的有效手段[3]。载体固定化技术不仅可以有效阻止功能菌种的流失，还使得生化系统的固液分离更加简便，从而提高生化系统的可操作性。固定化载体材料的选择是固定化技术应用的关键所在，合适的材料应当能为功能性微生物提供良好的附着性能并为微生物的生长繁殖提供适宜的场所。在以往的研究中，多种固定化材料被尝试用于脱氮细菌的固定化，如聚乙烯醇[4]、海藻酸钠[5]、聚氨酯泡沫[6]等。在有载体的情况下，功能性微生物固定在载体上的生长速率虽然没有游离状态下（未固定在载体上）的高，但是其对底物的摄取速率要明显高于游离状态[7]。目前，也有一些学者对新型生物载体（如生物质炭）展开研究，以期降低载体的成本和提高生物强化的性能[8]，新型的生物载体对环境也更加友好。

菌丝球是霉菌浸没式生长过程中在特定水力剪切力条件下自发缠绕成球形成的颗粒，其作为吸附重金属离子、染料等难降解有机物的材料已获得较为广泛的应用[9-10]。菌丝球由于其所具备的沉降速率快、易于固液分离、培养简便和对环境友好等特点，被越来越多的学者在研究中尝试用作一种新型的生物载体。Zhang等[11]将苯胺降解菌（Acinetobacter calcoaceticus JH-9）、化学需氧量（COD）快速降解菌与黑曲霉Y3形成的菌丝球混合培养后制成的改性菌丝球颗粒用于序批式反应器（Sequencing batch reactor， SBR）运行，对苯胺的降解速率起到了一定的促进作用。Wang等[12]利用黑曲霉Y3形成的菌絲球将产絮菌Agrobacterium tumefaciens F2和Bacillus sphaeicus F6固定后采用半连续发酵的方式持续产絮35个周期，直至改性菌丝球颗粒破碎。Zhao等[13]利用黑曲霉Y3形成的菌丝球固定产氢细菌Clostridium sp. T2进行产氢效能的研究，结果表明，经过菌丝球载体固定的产氢细菌的累积产氢量随着菌丝球载体的加入量增加而增加。此外，菌丝球作为生物载体也被广泛应用于产能微藻的培养和富集[14]，但是其作为载体在实际废水处理中的应用还需要进一步研究。

本研究将黑曲霉Y3形成的菌丝球作为生物载体用于固定好氧反硝化菌T13，对其固定前后对全氮的去除效能、菌群的活性进行研究并分析固定化对于生物强化脱氮效果的影响。此外，对胞外聚合物（EPS）的变化和固定前后的扫描电镜图像（SEM）进行表征。

1材料与方法

1.1菌丝球和好氧反硝化菌的培养

菌丝球的培养使用本课题组筛选的黑曲霉Y3作为菌种[15]。培养时采用孢子悬浮液作为接种液。将无菌去离子水加入长有黑曲霉Y3并生成了孢子的固体培养基之上，用经消毒的接种环轻轻将孢子刮下制成孢子悬浮液。将孢子悬浮液装入经灭菌的装有数粒玻璃珠的三角瓶内，加入适量的无菌去离子水使孢子悬浮液稀释到一定浓度，旋转振荡24 h使孢子悬浮液充分混匀分散后在620 nm波长下测量其吸光度OD620。使用孢子悬浮液时的接种量可用下列公式进行计算：

孢子悬浮液接种量=（0.25×0.1%×液体培养基体积）/孢子悬浮液吸光度

菌丝球的培养采用张斯[16]的方法。菌丝球的液体培养基成分为：蔗糖10.0 g，NH4Cl 1.0 g，KH2PO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5g，去离子水1 000 ml。按计算后的接种量接种后，在28 ℃140 r/min 条件下培养48～72 h。

好氧反硝化菌T13的菌种由本课题组筛选[17]。菌种经发酵培养后的菌液在8 000 r/min条件下离心5 min后弃置上清液，将沉淀的菌体使用20 mmol的磷酸缓冲液清洗2次后，使用漩涡振荡器重新悬浮并充分混匀。制成的T13菌种悬液的含量约为3.5×108CFU/ml。

1.2生物絮凝剂的制备

生物絮凝剂的制备采用产絮细菌F2[18]。将活化后的絮凝菌F2的菌液按5%的接种量接种到发酵培养基中发酵培养24 h后，按3∶1的体积比加入无水乙醇使生物絮凝剂析出，弃去无水乙醇，将絮凝剂置入透析袋中，在去离子水中除去乙醇后冻干备用。生物絮凝剂发酵培养基的成分为葡萄糖10.0 g，K2HPO4 5.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，去离子水1 000 ml，pH 7.2～7.5，在112 ℃、30 min条件下灭菌。

1.3改性菌丝球的制备

称取湿质量为30 g的菌丝球放入200 ml、0.2 g/L的生物絮凝剂溶液中，在磁力搅拌器30 r/min的搅拌转速下浸泡12 h，使菌丝球与生物絮凝剂充分接触后捞出，与30 ml的T13菌种悬浮液混合，在140 r/min、30 ℃下振荡培养24 h。

1.4多糖和蛋白质的提取及测定方法

多糖和蛋白质经加热后提取[19]。取25 ml充分混匀的样品置入离心管内，在11 000 g、4 ℃条件下离心15 min，弃置上清液，加入0.01%的NaCl溶液并定容至25 ml，使用漩涡振荡器将离心的沉淀重新完全混匀。将混匀后的样品在80 ℃水浴条件下加热30 min，冷却至室温后再次在上述条件下离心。离心后，将上清液经0.45 μm膜过滤后待测。

蛋白质的测定方法采用福林酚法[20]。取1 ml样品与5 ml试剂Ⅰ充分混合后静置10 min，然后加入0.5 ml试剂Ⅱ并立即混合，继续在室温下静置30 min后，使用紫外分光光度计在500 nm波长下测量吸光度。试剂Ⅰ的成分为溶液A与溶液B按50∶1的体积比混合，其中溶液A的成分为Na2CO3 10.00 g、NaOH 2.00 g、KNaC2H2O4·4H2O 0.25 g，定容至500 ml，溶液B的成分为0.5 g CuSO4 ，定容至100 ml。试剂Ⅱ为福林酚试剂。

多糖的测定方法采用苯酚-硫酸法[16]。取1 ml待测样品装入10 ml的离心管中，再加入1 ml去离子水和1 ml 6%的苯酚并摇匀，然后快速加入5 ml硫酸（98%，质量分数），静置10 min并充分混合，继续静置20 min并冷却至室温后，使用紫外分光光度计在波长490 nm处测量其吸光度。

1.5脱氢酶活性的测定方法

脱氢酶活性的测定采用TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）法[21]。取5.0 ml上清液样品加入5.0 ml Tris-HCl溶液（pH=8.4），再依次加入5.0 ml去离子水和10.0 ml 4%的TTC溶液。同时，在对照组中加入0.5 ml的甲醇。将样品组和对照组用水浴锅在37 ℃条件下水浴加热30 min。加热结束后，在样品组和对照组中同时加入5.0 ml三氯甲烷，密封后振荡10 min，萃取反应生成的TF（1，3，5-三苯基甲臜）。萃取结束后在3 000 r/min下离心5 min，离心结束后取下层三氯甲烷溶液在波长485 nm下测量吸光度。在测定菌丝球载体颗粒上的脱氢酶活性时，将样品摇匀并取5.0 ml的悬浮液，静置沉淀后将上清液弃置，再加入去离子水并定容至相同体积，后续步骤同上。

1.6傅里叶红外光谱（FTIR）样品的预处理及检测

菌丝球载体固定好氧反硝化菌T13前后的FTIR样品预处理及测定步骤如下：将菌丝球载体样品冻干后与溴化钾（KBr）按1∶100（质量比）混合并压缩，制成样品后使用Perkin Elmer Spectrum One B傅里叶变换光谱仪进行光谱测量。

1.7三维荧光光谱（EEM）样品的检测

三维荧光光谱使用日本Jasco的FP6500荧光光谱仪进行测量，发射波长为220～500 nm，波长扫描间隔为5 nm，吸收波长在220～600 nm内检测，步进为1 nm。测量速率设置为2 000 nm/min。

1.8电镜扫描图像（SEM）样品的预处理及检测

将样品置于使用0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.4）配制的4%戊二醛溶液中，在4 ℃下浸泡1 h，对颗粒表面的菌体进行固定，固定后使用相同的缓冲液清洗3次。将样品依次在50%、70%、80%和90%的乙醇溶液中浸泡15 min进行脱水，最后再在无水乙醇中浸泡15 min。脱水后的样品置于干燥器中保存待测。测量前，将脱水样品表面进行喷金处理再上机检测。

2结果与分析

2.1改性菌丝球负载T13对全氮的去除效能

将改性菌丝球（湿质量）与T13菌液按1∶30、1∶15、1∶10、1∶6的质量体积比分别负载后进行全氮去除效能的试验，以未添加改性菌丝球的T13菌液为对照。并在相同负载比例下与未经生物絮凝剂强化的菌丝球负载T13进行全氮去除效能的对比，结果如图1所示。从图1a中可以看出，培養至13 d时，未经生物絮凝剂强化的菌丝球负载T13后可较为明显地提升对全氮的去除效能，1∶15、1∶10和1∶6负载比例下的全氮去除率分别为43.09%、40.90%和40.91%，而T13菌液（对照组）的全氮去除率仅为26.09%。图1b中经过生物絮凝剂改性强化后的菌丝球负载T13后的全氮去除效能有了更为明显的提升，培养至13 d时，1∶15、1∶10和1∶6负载比例下的全氮去除率分别为52.10%、49.36%和50.26%。其中，以1∶15负载比例的菌丝球负载T13后的全氮去除率最为稳定。

不同负载比例条件下生物絮凝剂改性菌丝球负载T13对去除全氮效能的影响如表1所示。由图1和表1可见，在没有菌丝球作载体的情况下，尽管加入了生物絮凝剂，但游离的T13菌液对全氮的去除效能与未添加生物絮凝剂的差异并不显著（P>0.05），表明添加生物絮凝剂与否对T13游离菌去除效能没有显著影响。而在生物絮凝剂改性菌丝球负载T13之后，全氮的去除效能与未经生物絮凝剂改性的菌丝球相比，差异显著（P<0.05）。结果表明，在有生物絮凝剂改性强化的情况下，菌丝球负载T13去除全氮的效能有显著提高，从经济适用的角度出发，菌丝球的负载比例为1∶15较为合适，在满足全氮去除效能提升的前提下，无需更多菌丝球载体的加入。

2.2改性菌丝球负载T13的脱氢酶活性变化

由图2可见，经过和未经过生物絮凝剂改性强化的样品中，其上清液中脱氢酶活性随着培养时间的延长呈现急剧下降的趋势，而菌丝球载体颗粒上的脱氢酶活性则表现出持续上升的趋势。在T13固定后培养初期，液体培养基中存有大量的游离T13细菌，在每天更换50%培养基时，会随着弃置的液体流失部分菌体，因此上清液中的脱氢酶活性也随之降低。而颗粒上的菌量随着培养时间的延长则在不断增加，因此颗粒上的脱氢酶活性在逐渐升高。对比图2a、图2c，可以看出，生物絮凝剂改性与否对菌丝球负载T13后上清液中的脱氢酶活性影响较小，当负载比例为1∶15时，生物絮凝剂改性的菌丝球比未经改性的菌丝球负载T13后在连续培养第13 d时的上清液脱氢酶活性高2.55 mg/g。而对比图2b、图2d可以看出，培养第13 d时，负载比例为1∶15时生物絮凝剂改性的菌丝球比未经改性的菌丝球负载T13后的脱氢酶活性高了7.51 mg/g，提高幅度约62.3%。由于脱氢酶活性的强弱代表了T13活性的强弱和菌量的大小，因此这一结果证明，菌丝球的改性与否对上清液中T13的活性和菌量没有显著影响，而改性后的菌丝球使T13的固定化效果得到了较为显著的提升。

2.3改性菌丝球负载T13后蛋白质和多糖含量的变化趋势

由图3可知，蛋白质的含量在培养前7 d里呈现出下降的趋势，然后在后续的6 d内又呈现出了上升的趋势，负载比例为1∶15、1∶10和1∶6的改性菌丝球负载T13后的蛋白质含量在培养第13 d时分别达到了59.93 mg/g、65.23 mg/g和58.55 mg/g。前7 d的培养过程中，有部分菌体随着更换培养基时弃置的液体流失，因此蛋白质含量均降低，而在后6 d的培养过程中，随着固定在改性菌丝球载体上的T13生长繁殖，蛋白质含量升高。多糖的含量在13 d的培养过程中变化不是十分明显，总体呈现出较为平缓的趋势，到培养第13 d时除1∶15比例下的多糖含量比培养第1 d升高了3.21%外，1∶30、1∶10、1∶6和对照组中的多糖含量分别下降了4.95%、28.81%、39.84%和21.85%。负载比例为1∶15时多糖和蛋白质含量随时间变化的影响如表2所示，可以看出，培养至第13 d时，蛋白质含量相比于培养初始时有了显著降低，而多糖的含量在培养第4～7 d时稍有上升，至培养第13 d后又恢复了初始水平。这是由于作为载体核心菌丝球，其细胞壁主要组成中含有较大量的多糖[22]，且改性菌丝球负载T13的活性颗粒的多糖成分的主要来源是菌丝球。同时，培养过程中的培养基成分pH始终保持在6.8～7.0，而制备菌丝球的黑曲霉Y3并不适宜在这种环境下生长[23-24]，因此，菌丝球在这样的共培养条件下仅作为生物载体且生长速率极其缓慢。另外，菌丝球载体的结构在培养过程中可能也有少许破损脱落，因此多糖的含量有少许的降低。

2.4改性菌丝球负载T13后傅里叶红外（FTIR）光谱的变化

菌丝球和改性菌丝球负载T13后的FTIR光谱如图4所示，识别出的主要吸收峰如表3所示。两者的FTIR光谱吸收曲线大致相似，但在改性菌丝球负载T13后，也有几处波数下的吸收峰发生了变化。光谱在3 320 cm-1处的吸收峰较宽且深，是羟基基团中O-H键的伸缩振动引起的，在2 927 cm-1处的锐峰是C-H键的伸缩振动引起的。在1 154 cm-1处的吸收峰在改性菌丝球负载T13的曲线中变得更加锐利，这是典型的多糖中-O-C-O基团伸缩振动引起的吸收峰，结合3 320 cm-1处的宽峰，可以推断出菌丝球中含有大量的多糖类物质。在1 655 cm-1处的吸收峰是C=O和C-N （酰胺Ⅰ带）的伸缩振动引起的，1 540 cm-1处的吸收峰则是C-N的伸缩振动和N-H的形变振动（酰胺Ⅱ带）引起的，这2处吸收峰是蛋白质二级结构特有的FTIR吸收峰，并且在改性菌丝球负载T13的测定中吸收峰更加锐利，表明蛋白质在改性菌丝球负载T13的过程中起到了重要作用。1 400 cm-1处的吸收峰是天冬氨酸特有的去质子化的羧基中C=O的对称振动引起的，且该吸收峰在改性菌丝球负载T13时显现得更加明显，也表明蛋白质在菌丝球固定功能菌的过程中起到了作用。1 075 cm-1处的吸收峰则是多糖中C-O的不对称伸缩振动引起的，866 cm-1、541 cm-1和528 cm-1处的吸收峰则表明在改性菌丝球中不饱和键数量的增加。有研究结果表明，羧基和胺基与细菌附着固定在固体表面时的过程有关[25-27]。

2.5改性菌丝球负载T13后EEM的变化

选择1∶15负载比例条件下的改性菌丝球，取样后测定EEM随培养时间延长的变化，结果如图5所示。从图5中可以看出，样品的EEM图包括了4个明显的峰。第1个主峰是激发/发射波长（Ex/Em），位于280 nm/340～345 nm处的A峰，第2个主峰是Ex/Em，位于230 nm/330～340 nm处的B峰。据报道，这2个峰的荧光与蛋白质类物质的存在相关，A峰所在的位置主要和芳香类、蛋白质类物质的存在相关，B峰位置则主要和色氨酸类、蛋白质类物质相关[28-30]，荧光的强度与物质的含量密切相关，荧光的强度越高，则峰所在位置代表的物质含量越高。A峰和B峰的荧光强度在起初7 d的培养时间里有略微的减弱，在后续7 d的培养过程中又有明显的增强。这一结果表明，在前7 d里，有部分的T13菌体还没有固定在改性菌丝球表面，随着置换的培养基被一起排出体系，而在后续7 d的培养过程中，随着固定在表面的菌体的生长繁殖，此类蛋白质类化合物的数量也有升高。

第3个峰是Ex/Em，位于365～370 nm/450～460 nm处的C峰，C峰所在位置主要与类腐殖酸物质相关。第4个峰是Ex/Em，位于280～285 nm/450～460 nm处的D峰，主要与类富里酸物质相关[31]。对比改性菌丝球负载T13第13 d时和第1 d时的最大荧光强度峰的位置，可以发现C峰和D峰有较为明显的蓝移，C峰从Ex/Em=360 nm/466 nm藍移至Ex/Em=360 nm/444 nm处，D峰则从Ex/Em=285 nm/460 nm蓝移至Ex/Em=285 nm/455 nm处。荧光强度最高峰的位置变化表明，EPS中的部分物质在共培养过程中产生了变化，可能是由于T13的生长代谢产生了新的代谢产物。

2.6改性菌丝球负载好氧反硝化菌T13的变化及SEM图像

将改性菌丝球负载T13后连续培养45 d，每天取出培养瓶静置沉淀后拍摄图像。如图6所示，改性菌丝球负载好氧反硝化菌T13后的变化较为明显。图6a所示为培养24 h后的菌丝球在未经生物絮凝剂改性时的情况，图6b所示为经过生物絮凝剂改性后的菌丝球负载T13培养第4 d时的情况，可见颗粒已经由白色变为浅黄色。经过15 d的培养后，颗粒颜色逐渐加深，且有少量浑浊出现，这是由于改性菌丝球表面的T13生长繁殖后，菌量变大而进入培养基中，也有少量断裂的菌丝携带附着的T13从菌丝球表面剥落所致。连续培养至第45 d时，改性菌丝球颗粒仍能保持完整的结构，颗粒直径相比于纯菌丝球有略微的增大，但颗粒的颜色已经由浅黄色变为黄褐色，且培养基中有大量的黄褐色絮体，结合2.2节中得出的脱氢酶活性随培养时间延长而提升，表明在改性菌丝球颗粒培养的过程中，T13的菌量有明显的提升，不仅在改性菌丝球颗粒的表面附着生长，且进入液体培养基的游离菌体能够形成具有活性的絮体。

改性菌丝球负载T13的SEM图像也可以表明菌丝球固定T13强化后的效果。由图7a、图7 b可以清晰看出，改性菌丝球表面负载了大量的T13细菌，能够维持较为完整的颗粒状结构，横截面SEM图像（图7c、图7 d）表明，改性菌丝球的内部是由菌丝缠绕在一起形成的紧密网状结构，为颗粒的整体提供了支撑，且能为改性菌丝球提供较大的比表面积和良好的传质性能，使得T13细菌得以在改性菌丝球表面附着生长。黑曲霉Y3形成的菌丝球作为生物载体也被用于固定产氢细菌[32]和产絮菌[12]以提高氢气和生物絮凝剂的产量，在这些研究中，产氢细菌和产絮菌也成功地固定在了菌丝球的表面。

3讨论

菌丝球作为生物载体在以往的研究中被用于其他一些功能微生物的固定，并用于强化污染物的去除，Dong等[33]利用黃孢原平毛革菌DH-1形成的菌丝球负载光合细菌PSB-1D，用于强化2-氯酚的去除，发现用同时培养法形成的混合菌丝球在7 d内对2-氯酚的降解率可达89%以上。林胜红等[34]使用烟曲霉形成的菌丝球固定另一株产漆酶的荧光假单胞杆菌后处理刚果红废水，结果表明，被固定后的混合菌丝球对废水的脱色效能和染料的降解效率都有了明显提升。在本研究中，菌丝球负载T13对全氮的去除效能有较大的提升，在未经生物絮凝剂改性强化的情况下，当负载比例为1∶15时，可使全氮的去除率提升约17.00%，而经过生物絮凝剂改性强化后，全氮的去除率在相同条件下又可提升9.01%。生物固定强化技术主要目的在于提升体系中功能微生物的生物量，提高其在系统中的活性[35]。从脱氢酶活性的变化可以看出，T13可以在菌丝球的表面附着生长，菌丝球载体颗粒表面的脱氢酶活性在逐渐升高，而在生物絮凝剂改性强化菌丝球之后，仅培养7 d后，载体表面的脱氢酶活性就有明显的提高，同时去除全氮的效能相比于游离菌也有较大改善，说明经过生物絮凝剂改性的菌丝球可以强化好氧反硝化菌T13的固定，增强T13在体系中的菌量和活性。

有研究结果表明，在微生物负载在载体表面的过程中，EPS起到了重要作用。王鑫等[36]用膨胀石墨-海藻酸钙法固定石油菌T4的过程中发现，T4附着在载体表面的时候会分泌大量的EPS。田秀梅等[37]采用乙酸改性苎麻纤维为载体吸附固定石油降解菌时也发现，细菌自身产生的胞外聚合物增强了对载体材料的黏附。而在膜生物反应器的研究中也发现，通过减少EPS的产生可以有效预防微生物群体附着在膜的表面，有效减少膜污染的发生[38]。在本研究中，FTIR的图谱分析结果表明，多个蛋白质或多糖中含有的基团的吸收峰在改性菌丝球负载T13前后产生了变化。而从EEM分析结果中可以看出，EPS的含量在13 d的培养中经历了先降低后升高的过程，尽管在前7 d中被固定的T13菌量有少许下降，但在后续的培养过程中其菌量和活性都有所提高，这一结果表明，EPS在改性菌丝球负载T13的过程中起到了关键作用，特别是蛋白质，有助于T13在菌丝球表面的固定。

改性菌丝球培养过程中的表观图像及SEM图像表明，改性菌丝球可以作为生物载体将好氧反硝化菌T13有效固定在其表面。经过45 d的培养后，改性菌丝球载体仍能保持完整、良好和紧实的结构，菌丝缠绕形成的表面提供了较大的比表面积供细菌附着，而T13菌体附着后也可以继续生长繁殖，且从载体表面脱离下来的菌体也能够形成具有活性的絮体，避免在固液分离的过程中被排出系统导致流失。

致谢：本项目受黑龙江省“头雁”计划项目《寒区生态环境保障理论技术》资助，特此感谢！

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2021-08-13

基金项目：国家自然科学基金项目（52070054）

作者简介：孔祥震（1989-），男，安徽宿州人，博士研究生，研究方向为环境微生物、生物强化技术。（E-mail）kxz_19890510@163.com

通讯作者：马放，（E-mail）mafang@hit.edu.cn