基于多世代分离群体的花生网斑病抗性遗传分析

刘华　秦利　杜培　孙子淇　齐飞艳　张忠信　徐静　韩锁义　代小冬　董文召　张新友

摘要：为了阐明花生网斑病抗性的遺传规律，以抗病性存在明显差异的2个亲本组配的2个多世代群体为研究对象，应用分离群体分析方法（SEA）进行遗传模型分析。结果表明，花生网斑病的抗性遗传表现为E-1（MX2-ADI-AD）模型，即2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制，以主基因遗传为主，与抗性相关的主基因遗传率在不同群体材料（W1701：YH×G99，W1702：G99×YH）中分别表现为80.09%和88.29%，基因的遗传效应以加性效应和显性效应为主。研究结果为花生网斑病抗性基因定位和抗性育种奠定了理论基础。

关键词：花生;网斑病抗性;遗传模型分析

中图分类号：S513文献标识码：A文章编号：1000-4440（2022）02-0326-08

Genetic analysis of peanut web blotch resistance based on multi-generation segregation population

LIU Hua，QIN Li，DU Pei，SUN Zi-qi，QI Fei-yan，ZHANG Zhong-xin，XU Jing，HAN Suo-yi，DAI Xiao-dong，DONG Wen-zhao，ZHANG Xin-you

Abstract：In order to elucidate the genetic regularity of the resistance for peanut web blotch， two multi-generation segregation populations were used to analyze the genetic model of peanut web blotch resistance. The parents of the two segregation populations showed obvious difference for peanut web blotch. Segregation analysis （SEA） was used to comprehensively study the genetic inheritance of peanut web blotch resistance. The results indicated that the optimal genetic model for peanut web blotch resistance was E-1 （MX2-ADI-AD）， that was， two pairs of additive-dominant-epistatic major genes + additive-dominant polygene model. The heritabilities of major genes for two populations were both above 80%， which were significantly higher than those of polygenes， and the genetic effects of genes were mainly additive and dominant.

These results lay a theoretical basis for gene mapping and new resistance peanut varieties breeding.

Key words：peanut;web blotch resistance;genetic model analysis

花生网斑病是危害中国花生生产的重要病害之一，在严重发生区域可使花生减产30%以上。药剂防治是生产上防治花生网斑病的主要方式，不仅费工费时，而且易造成农药残留等问题，从而导致花生品质降低。因此开展花生对网斑病的抗性研究，深入了解其遗传规律并挖掘抗病基因位点，可以为花生抗网斑病新品种培育和分子标记辅助育种提供理论和关键技术支撑，是解决花生网斑病危害问题的最有效途径。

20世纪70年代，在美国等地区发现花生网斑病。20世纪80-90年代，中国研究者在中国东北、山东、陕西和河南等花生主产区发现该病害对花生生产产生了严重威胁[1-3]。早期针对花生网斑病的研究多集中在病害鉴定和防治方面，随后有研究者开展了花生网斑病病菌的观察、分离和鉴定等工作[4-7]。近几年来，Liu等[8]利用栽培种花生郑8903和豫花4号作为亲本构建的重组自交系群体开展多年、多环境条件下花生网斑病数量性状座位（QTL）的定位研究，结果分别在A04、A14染色体上发现了与抗病性相关的QTL，其贡献率分别为2.8%、15.1%。研究者通过对国内外花生种质资源的鉴定，已经发现了具有网斑病抗性的材料，但是关于网斑病抗性遗传规律和模式等的报道较少[9-10]，因此目前花生网斑病抗性遗传的研究相对薄弱。盖钧镒等[11]在20世纪末至21世纪初提出了植物数量性状主基因加多基因混合分布遗传理论，并开发了一系列主基因加多基因遗传模型。许多研究者利用该模型对水稻、小麦、玉米、大豆和棉花等作物的复杂数量性状进行了遗传模式探讨，不仅为深入开展相关研究奠定了基础，还初步在新品种选育和改良的实践中得到了应用[12-13]，该模型在小麦赤霉病抗性、水稻条纹叶枯病抗性、玉米茎腐病抗性和棉花黄萎病抗性等研究中也发挥了重要作用[14-16]。本研究利用花生网斑病抗病和感病材料构建了2个4世代群体材料，结合主基因加多基因混合分布遗传模型的研究方法开展花生网斑病抗性遗传的初步分析，以期为进一步的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1材料来源2016年夏季通过田间接种鉴定，筛选出了YH、G99等网斑病抗性差异明显的花生种质。2016年冬季，经过室内人工接种鉴定，确认了上述材料的抗性差异，其中YH是高感网斑病种质，为珍珠豆型中果品种;G99是抗病种质，为普通型小果品种。

1.1.2杂交组合的配制及F1代真实性的鉴定2017年夏季，在河南现代农业研究开发基地利用上述材料配制了正反交组合[W1701：YH（母本）×G99（父本），W1702：G99（母本）×YH（父本）]。2个杂交组合分别收获了28个、19个杂交荚果。

为了确保本研究所用的F1代种子均为真杂种，应用竞争性等位基因特异性PCR（KASP）分子标记技术开展杂种真实性鉴定。

经过亲本多态性标记筛选，分别获得双亲间差异明显的KASP标记。基于此，分别取2个组合的亲本和F1代幼嫩叶片，提取基因组DNA，进行KASP分子标记检测，基因型与亲本一致的纯合型为假杂种（共2株），基因型为杂合型的为真杂种（共25株）（图1、表1）。依据分子标记检测结果，剔除伪杂种，用真杂种进行花生网斑病的鉴定和遗传分析。

1.1.3南繁加代为了便于在同一生长季进行P1、P2、F1和F2等4个世代材料网斑病发生情况的鉴定，2017年冬季，取约2/3的F1代种子进行南繁加代工作。

1.2田间试验设计

于2018年5月17日播种，每个杂交组合的亲本（P1、P2）、F1代、F2代按順序单粒点播，行长6.67 m，行距0.40 m，每行40株，株距0.17 m。亲本各种植1行，F1、F2代依据种子量播种1至多行。田间管理参照常规措施，全生育期不喷施杀菌剂，根据需要防治虫害，及时进行除草、灌溉等农艺措施。

1.3花生网斑病抗性鉴定

1.3.1田间接种方法花生网斑病病原菌液的制备和田间接种鉴定方法参考王振宇等[17]的专利。花生播种后60 d左右（或花期）进行田间网斑病病原菌人工接种，接种的适宜时间为17∶00以后，采用田间喷雾接种方式。病原菌菌液的制备：通过室内马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基，在光-暗周期为12 h-12 h、温度为（26±1） ℃的条件下培养7～10 d，制备成质量浓度为1.6×10-3g/ml的菌丝悬浮液，添加适量吐温20以增加菌丝在植株上的附着力，于4 ℃冷藏备用。

1.3.2田间抗病性鉴定标准花生网斑病的田间鉴定参考花生叶斑病国际9级标准并计算病情指数，详细分级标准如下[18]：1级，无病斑;2级，基部老叶出现很小的病斑;3级，在2级基础上，病斑出现孢子;4级，中下部大量叶片出现病斑，病症明显;5级，中下部叶片出现大量病斑，基部叶片出现发黄脱落现象;6级，在5级的基础上，叶片病斑更多;7级，全叶遍布病斑，中下部叶片脱落;8级，与7级类似，落叶严重;9级，落叶占95%以上。病情指数计算方法：病情指数=[（病级×相应病株数）/（9×调查总株数）]×100。

1.3.3田间表型数据采集和整理以抗病和感病亲本作为对照，对杂交后代（F1、F2）进行表型鉴定。各杂交组合后代群体的大小：W1701的F1代，共14株，F2代，共480株;W1702的F1代，共11株，F2代，共262株。

用Excel 2010对表型数据进行初步整理和分析。

1.4主基因加多基因遗传模型分析

采用盖钧镒等[11]提出的P1、P2、F1和F2多世代联合分析方法，开展关于花生网斑病抗性的遗传模型分析。应用曹锡文等[19]开发的植物数量性状主基因加多基因混合分布遗传模型软件的分离分析法（Segregation analysis，SEA），利用极大似然估计和IECM等算法估算出各世代和各成分分布的遗传参数，并通过Akaike信息准则（Akaikes information criterion）值（AIC值）最小准则和适合性检验[包括均匀性检验（U12、U22和U32）、Smirnov检验（nW2）和Kolmogorov检验（Dn）]，选出最适遗传模型;结合最小二乘法和最优遗传模型的一阶遗传参数估计各基因的效应值和方差等二阶参数。

2结果与分析

2.1亲本及杂交后代群体抗病性鉴定

田间人工接种结果表明，YH和G99的发病情况差异较明显，YH发病严重，叶片病斑多且有落叶，G99的抗病性较好，叶片未发现斑点或仅有极小的斑点（图2）。经过室内接种鉴定，YH和G99的病情指数分别为71.67和18.52，其发病情况见图3。

利用花生网斑病病菌菌丝悬浮液，在田间对2个杂交组合的亲本、F1代、F2代进行人工接种鉴定。从表2、图4可以得出，杂交组合W1701母本（YH）和父本（G99）的平均病级和病情指数差异明显，F1代的平均病级和病情指数分别介于双亲之间，与抗病亲本病级接近;反交组合W1702的F1代抗病性表现与正交组合基本一致。由此可见，G99表现出的花生网斑病抗性是由不完全显性基因控制的，且抗病性以细胞核遗传为主。正反交F2代表型变异丰富，抗/感病级呈连续分布状态（表2、图5）。2个组合的F2代表型呈连续和偏态分布特征，表明花生网斑病抗性是典型的数量性状，受主基因调控且存在多基因效应。

2.2抗病性主基因加多基因的遗传模型分析

应用SEA软件，分别对正反交组合的网斑病抗性进行主基因加多基因遗传模型分析。结合亲本、F1代和F2代田间病害调查结果，选择G4F2群体类型，即4世代群体进行联合分析。结果表明，每个组合均得到了5类24种遗传模型的极大似然值和AIC值（表3），分别是1对主基因（A）、2对主基因（B）、多基因（C）、1对主基因加多基因（D）和2对主基因加多基因（E）。

2.2.1抗病性遗传模型的选择和适合性检验依据极大似然值和AIC值，W1701组合的B-2、E-1和E-2可以作为候选模型，其反交组合W1702的候选遗传模型为E-0、E-1和E-3。模型的初步选择结果表明，花生网斑病抗性可能主要由2对主基因+多基因控制，最优遗传模型的选择还应依据AIC准则和适合性检验结果。

综合考虑AIC值最小准则和5个适合性检测参数（U12、U22、U32、nW2和Dn）达到显著或极显著水平的数量最少的模型，得出最优遗传模型。由表4可以看出，在正交组合W1701的3个候选模型中，AIC值最小的遗传模型为E-2，适合性检验参数中有2个达到了极显著水平，此外E-1模型中适合性检验参数达极显著水平的有2个，B-2模型中有1个参数达到显著水平，2个参数达到极显著水平。因此，该组合遗传模型的选择集中在E-1、E-2。在反交组合W1702中，模型按AIC值从小到大排序依次是E-1、E-3和E-0，其适合性检验的20个参数（4个世代中每个世代均对应U12、U22、U32、nW2和Dn）中达到显著、极显著水平的数量分别为4个和3个、3个和5个、4个和3个。因此，首先可以排除E-3为最优遗传模型，进一步可选择的模型是E-1和E-0。结合正反交遗传模型分析结果，E-1模型（MX2-ADI-AD，2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因）为最优遗传模型。

2.2.2抗病性遗传参数估计依据正反交4世代群体抗病性最优遗传模型，进一步估算出各成分分布的一阶和二阶遗传参数（表5、表6），并绘制各成分分布的拟合曲线（图6）。控制花生网斑病抗性的2对主基因的加性效应∣da∣>∣db∣，表明第1对主基因的加性效应（da）大于第2对主基因的加性效应（db），即以第1对主基因的加性效应为主。2对主基因的显性效应表现为∣ha∣>∣hb∣，即第1对主基因的显性效应（ha）大于第2对主基因的显性效应（hb），显性效应明显。控制花生网斑病抗性的第1对主基因的显性度表现为∣ha/da∣<1，表明第1对主基因的遗传效应以加性效应控制为主;第2对主基因的显性度在不同群体材料中的表现不一致。此外，2对主基因之间存在上位性效应，且加性×加性互作效应（i）>0，表明主基因间的加性效应具有相互增强的作用;其显性×显性互作效应（l）的值不一致，表明这2对主基因之间显性互作效应不同;第1对主基因的加性×第2对主基因的显性互作效应（jab）和第2对主基因的加性×第1对主基因的显性互作效应（jba）在2个组合中的表现不同，说明控制花生网斑病的这2对主基因对提高抗病性的贡献是不相等的。多基因的遗传效应在正反交群体材料中的表现一致，即∣[d]∣<∣[h]∣，表明影响抗病性的多基因遗传效应以显性效应为主。综上所述，控制花生网斑病抗性的2对主基因遗传效应以加性为主，其中以第1对主基因的加性遗传效应为主;2对基因间的互作能够增强抗性，但贡献不同，同时多基因的遗传效应也表现出以显性效应为主。

由不同组合的二阶遗传参数看出，在W1701（YH×G99）和W1702（G99×YH）组合中，G99网斑病抗性主基因在F2代群体中表现的遗传率分别为80.09%和88.29%，多基因遗传率仅在正交组合中检测到且其值较小（1.93%），表明G99的抗病性受主基因控制，主基因效应明显。

3讨论

3.1遗传群体抗病性鉴定分析

花生网斑病是威胁花生生产的重要真菌性叶部病害之一，为了有效提高花生品种的抗病性，实现减药增收的生产目标，选育和推广抗病品种是最佳途径[1，20-22]。然而，关于花生网斑病抗性研究的基础较差，使其在实践和生产中的应用困难。本研究通过人工接種鉴定获得抗、感花生网斑病的花生种质资源，利用抗感材料配制了正反交组合，以期了解花生对网斑病抗病性和感病性之间的显隐性关系和遗传规律等。为了保证杂种F1代的真实性，采用高通量KASP分子标记检测技术，对每株F1代花生植株进行真杂种鉴定。经过对双亲和F1代人工接菌鉴定，发现正反交F1代的抗病性表型一致，说明抗病性主要受细胞核遗传控制;F1代植株的病级或病情指数位于双亲之间，且偏向抗性亲本，表明抗病性对于感病性具有不完全显性效应。经过F1代自交繁殖，产生了2个表型变异丰富的F2代群体，保障了后续遗传模型研究的开展。

3.2多世代联合主基因+多基因遗传分析

植物数量性状主基因加多基因遗传模型分析方法在动植物遗传研究中均有应用，关于植物抗病性遗传研究的报道也较多[15，23]。利用该分析方法，许多研究者开展了花生重要农艺、产量、品质、抗逆性和抗病性相关性状的遗传模型分析，为对花生的重要性状进行遗传改良等提供了重要参考依据[24-30]。本研究通过多世代（P1、P2、F1和F2）的联合分析，发现花生网斑病抗性遗传符合E-1（MX2-ADI-AD，即2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因）模型。通过遗传模型的一阶和二阶参数分析发现，控制花生网斑病抗性的2对主基因的遗传率均大于80%，但是效应不同。主要是第1对主基因的加性和显性效应起作用，第2对主基因在与第1对主基因产生加性×加性互作时能够增强抗病性;仅在其正交群体中检测到了1.93%的多基因遗传率，表明多基因在抗病性遗传中的效应较小。因此，在之后的研究或实践过程中，应重点关注抗病亲本G99的主基因遗传效应。综上所述，花生网斑病抗性受2对主基因加性-显性-上位性+多基因加性-显性控制，主基因遗传效应明显，因此利用抗病种质G99能够有效进行遗传改良，即通过有性杂交和回交等技术可以培育出花生网斑病抗性新品种。本研究结果也为花生网斑病抗性基因发掘和遗传研究提供了理论和材料基础。

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（责任编辑：徐艳）

收稿日期：2021-06-07

基金项目：河南省现代农业产业技术体系项目（S2012-5）;河南省公益重大专项项目（201300111000）;国家现代农业产业技术体系项目（CARS-13）;河南省农业科学院科研发展专项项目（2020CX07）

作者简介：刘华（1984-），男，河南尉氏人，博士，助理研究员，主要从事花生遗传育种研究。（E-mail）liuhua703@126.com

通讯作者：张新友，（E-mail）haasz@126.com