成人流感样病例13种病原体检测情况及多重PCR毛细电泳片段分析法检测的临床应用

涂 鹏，史大伟，宛瑞杰，田秀君，窦海伟，袁 青，陈小华，辛德莉

首都医科大学附属北京友谊医院/北京热带医学研究所/热带病防治研究北京市重点实验室，北京 100050

流行性感冒(以下称流感)是流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，人群普遍易感，部分患者可出现肺炎等并发症或基础疾病加重发展成重症病例，甚至可能导致死亡。流感样病例(ILI)指发热(体温≥38 ℃)伴咳嗽或咽痛之一的患者[1]。目前，国内外针对ILI主要检测甲型/乙型流感病毒(InfA-InfB)[2-3]，感染人流感病毒主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系[4]。有研究者对流感季节的ILI进行多重聚合酶链反应(PCR)检测，发现近60%的ILI是由非流感病原体引起，ILI并非全部由流感病毒感染所致[5]。本研究对2019年12月至2020年2月北方部分地区的189份ILI咽拭子标本进行13种呼吸道病原体检测，探究成人ILI中13种病原体分布情况及多重PCR毛细电泳片段分析法在病原体检测中的应用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年12月至2020年2月南阳医学高等专科学校第一附属医院、漯河市中医院、北京中日友好医院、开封市中医院、黑龙江省红十字医院(哈尔滨)、秦皇岛市第二医院、潍坊市第二人民医院治疗成人ILI的咽拭子标本。纳入标准：以《全国流感监测方案(2017年版)》[1]ILI为标准，即发热(体温≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。排除标准：(1)病程>72 h；(2)有明确细菌感染或明确诊断为其他疾病；(3)新型冠状病毒阳性。本研究共收集到189例患者非重复性ILI咽拭子标本189份，其中男73例，女116例；年龄16～60岁；南阳医学高等专科学校第一附属医院48例，漯河市中医院19例，中日友好医院7例，开封市中医院57例，黑龙江省红十字医院(哈尔滨)46例，秦皇岛市第二医院5例，潍坊市第二人民医院7例。本研究经本院伦理会批准(批件号：2021-P2-113-01)。

1.2方法

1.2.1咽拭子标本采集 采集咽拭子标本采用尼龙材质植绒拭子，所有入组病例采集咽拭子后放入咽拭子管中，置于-80 ℃或-20 ℃冰箱中冷冻保存,标本统一经冷链运输到中心实验室，集中进行流感病毒核酸检测。

1.2.2核酸提取 采用核酸提取或纯化试剂BD-Micro型试剂盒(宁波市重鼎生物技术有限公司，批号20190212)。具体操作按照试剂盒说明书要求进行。

1.2.313种呼吸道病原体多重检测 13种呼吸道病原体多重检测试剂盒购自宁波海尔施基因科技有限公司(批号210118005)。病原体包括InfA、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、甲型流感病毒HINI(2009)(InfA-H1N1)、季节性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、人偏肺病毒(HMPV)、InfB、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、冠状病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)。

1.3多重PCR毛细电泳片段分析

1.3.1多重RT-PCR扩增与PCR产物毛细电泳片段分离 应用13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司,批号210118005)。具体操作按照试剂盒说明书要求进行。

1.3.2结果判定 检测数据由ABI公司的“Genemapper software”软件进行分析，各病原体对应扩增片段信息如下：InfA 102.5 nt、HADV 112.7/114.7 nt、Boca 121.1 nt、HRV 129.5 nt、InfA-H1N1 158.6 nt、HPIV 179.1 nt、CP 188.2 nt、HMPV 199.9 nt、InfB 207.0 nt、MP 212.3 nt、InfA-H3N2 241.0 nt、HCOV 261.7 nt、RSV 276.7 nt，nt是“Nucleotide”的缩写。待测样品有人RNA、DNA特征峰且峰高度高于该毛细管中标准品高峰的说明标本核酸未明显降解且核酸提取成功，反之则说明取样失败、核酸严重降解或核酸提取失败。IC作为内置PCR内参监控整个操作流程,若其他特征峰明显，由于竞争扩增原因IC峰可能降低甚至消失,满足以上条件后再对核酸检测结果峰型图进行判读,比对各个毛细管泳道目的位点峰与该道标准品的高峰和低峰来判定阴阳性[6]。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据处理及统计学分析。计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.113种呼吸道病原体分布情况 189份ILI咽拭子标本中有180份(95.24%)检测出病原体，9份未检测出病原体。单一病原体150份(83.33%)，多种病原体30份(16.67%)；未见Boca、HPIV、CP、RSV。180份病原体阳性标本中有145份(80.56%)检测出流感病原体，35份(19.44%)检测出非流感病原体。145份流感病原体阳性标本中120份(82.76%)检测出单一流感病原体，25份(17.24%)同时检测出流感病原体与非流感病原体。35份非流感病原体阳性标本中30份(85.71%)检测出单一的非流感病原体，5份(14.29%)检测出多种非流感病原体。见表1。

表1 ILI咽拭子标本中13种呼吸道病原体分布情况[n(%)]

2.2不同年龄段病原体分布情况 不同年龄段仅InfA-H3N2阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，>25～45岁InfA-H3N2阳性率低于其他组(P<0.05)。不同年龄段标本病原体阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同年龄段ILI病原体分布情况[n(%)]

年龄(岁)nMP阳性HCOV阳性HMPV阳性HADV阳性单一病原体感染混合感染>15～25619(14.75)0(0.00)0(0.00)0(0.00)53(86.89)6(9.84)>25～457710(12.99)2(2.60)0(0.00)1(1.30)57(74.03)15(19.48)>45～60425(11.90)0(0.00)1(2.38)0(0.00)32(76.19)8(19.05)>6092(22.22)0(0.00)0(0.00)0(0.00)8(88.89)1(11.11)χ21.101---4.0372.873P0.816---0.2380.403

2.3不同地区病原体分布情况 不同地区标本病原体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。不同地区标本流感、InfA-H3N2、MP阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)。北京、南阳、开封、哈尔滨地区流感阳性率高于其他地区(P<0.05)；北京、南阳、开封地区InfA-H3N2阳性率高于其他地区(P<0.05)，但3组间差异无统计学意义(P>0.05)；秦皇岛、潍坊地区MP阳性率高于其他地区(P<0.05)，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同地区ILI病原体分布情况[n(%)]

续表3 不同地区ILI病原体分布情况[n(%)]

3 讨 论

流感是一种常见呼吸道传染性疾病，甲型和乙型流感每年呈现季节性流行特点，其中甲型流感可引起全球大流行。美国疾病控制与预防中心监测数据显示，流感每年能导致29万～64万人死亡，高于世界卫生组织之前预测的25万～50万人[7]，给全球卫生经济带来极大的负担。《中国成人流行性感冒诊疗规范急诊专家共识》[8]指出，快速鉴定流感病毒亚型对及时救治感染病例及制定有效的流感疫情防控措施有至关重要的作用。既往研究发现，我国甲型流感的年度周期性随纬度增加而增强，且呈多样化的空间模式和季节性特征，在北纬≥33°的北方地区呈冬季流行模式，每年1-2月为单一年度高峰；在北纬<27°的南方地区，每年4-6月为单一年度高峰；二者之间的中纬度地区每年1-2月和6-8月为双周期高峰；而乙型流感在我国大部分地区的寒冷季节单发[9]。

本研究对北方地区189份成人ILI咽拭子标本的病原体学检测结果显示，145份流感阳性标本中有111份为InfA-H3N2、23份InfA、7份InfA-H1NI、4份InfB，以InfA-H3N2为主，与马春娜等[10]、李静等[11]、陈斌等[12]、舒畅等[13]及国家流感中心发布的流感监测周报[14]报道北方地区流感季流感病毒流行株流行情况相同。本研究结果显示，不同地区标本流感、MP、InfA-H3N2阳性率存在差异性，可能与不同地方流感进入流感季的时间不同及不同地区流感优势株的占比不同有关。不同年龄段InfA-H3N2阳性率存在差异性，>25～45岁InfA-H3N2阳性率低于其他年龄组。可能该年龄段人群机体状态优于其他组，不同地区标本InfA-H3N2检测阳性率存在差异性可能与样本量有关。

本研究对流感病原体进行检测的同时也对引起常见呼吸道感染的非流感病原体进行检测，结果发现，145份流感阳性标本中有23份混合MP感染，2份混合HRV感染，35份检测出非流感病原标本中有MP26份、HCOV2份、HADV1份、HMPV1份、MP合并HRV3份、MP合并HCOV2份。提示引起ILI的病原体中非流感病原体并不在少数,也可见混合感染的存在。目前国内外对ILI病原体主要进行InfA/InfB的病原体监测，很少涉及非流感病原体的检测[2-3]。张扬等[15]、翁坚等[16]对ILI病毒病原体谱特征分析发现，引起ILI的病毒并非只有流感病毒，也有HRV、HMPV、HPIV、 HADV等其他常见呼吸道病毒，但均未发现MP、CP。本研究发现，成人ILI病原体中MP的阳性率并不低。史大伟等[17]使用相同的检测方法对北京地区儿童冬季ILI病毒病原体分析发现，引起ILI的有RSV、HMPV、HRV、HADV、HCOV、MP等非流感病原体，但针对成人ILI的13种病原体检测研究鲜见报道。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第8版)》[18]中指出新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测。本研究使用多重PCR毛细电泳片段分析法能同时检测流感病毒、HADV、RSV、MP等13种病原体，能满足当前疫情防控检测需要；与传统的常规检测技术相比，多重PCR毛细电泳片段分析法能同时对流感病毒亚型和非流感病原体进行鉴定，缩短了病原体检测时间，并且灵敏度与特异度更高，有助于有效控制抗菌药物的使用及流感疫情发展[19-20]。但由于本研究部分地区病例较少,研究时间主要集中在流感季节，结果存在一定局限性,接下来应扩大样本量并对全年标本进行收集，以期更好地评估ILI中病原体分布情况。

综上所述，2019年12月至2020年2月冬季我国北方地区的成人流感病毒主要以InfA-H3N2为主；非流感病毒也可引起ILI，以MP感染较多见，也可见HCOV、HADV、HMPV感染；部分ILI可有混合感染，以InfA-H3N2合并MP感染为主。多重PCR毛细电泳片段分析不仅能缩短不同病原体检测时间，还能满足当下疫情防控检测的需要，更能为临床ILI病原体诊断提供科学性证据，减少临床抗菌药物的滥用情况，降低抗菌药物耐药性的风险。