兰香草水煎液急性毒性试验和止血抗炎镇痛作用

陈美安 ， 莫晓方 ， 吴小燕

(广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001)

兰香草为马鞭草科莸属植物兰香草[Caryopterisincana(Thunb.) Miq.]的全草或带根全草，具有疏风解表、祛寒除湿、散瘀止痛等功效，可用于治疗风寒感冒、百日咳、慢性支气管炎、肝炎、胃肠炎、外伤出血及产后瘀血等疾病[1-4]。本课题组前期研究发现，兰香草70%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和余下水部位均具有较好的抗炎活性[5]。另外，兰香草水提取液中可能含有鞣质、有机酸、糖类、苷类、蛋白质和多肽类等多种类型成分[6]。现代药理研究表明，兰香草具有抗菌、镇咳、祛痰、保肝、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶等生物活性[7-12]。因此，本试验以兰香草为研究对象，考察其水煎液的急性毒性及止血、抗炎、镇痛作用，为该药材在中医及兽医临床的应用提供理论依据，并为其合理开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明系小鼠，SPF级，体重为18～22 g，雌雄不限，购自湖南斯克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证为SCXK(湘)2016—0002。

1.2 药物与试剂 兰香草药材，采自广西河池，经广西中医药大学朱意麟实验师鉴定为马鞭草科莸属植物兰香草[Caryopterisincana(Thunb.) Miq.]的干燥全草，阴干，备用。云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZMA1605)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：151011)；阿司匹林肠溶片(湖南新汇制药有限公司，批号：170406)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20121212)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20060419)；角叉菜胶(上海如吉生物科技发展有限公司，批号：160411)；水为蒸馏水；其余化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备 AJ150电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)；UV-1780紫外可见分光光度计(岛津仪器苏州有限公司)；RB-200智能热板仪(成都泰盟软件有限公司)；TGL-166离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH-S 恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)。

1.4 兰香草水煎液的制备 将兰香草药材粉碎成粗粉，取药材粗粉2 500 g，加入10倍量水，浸泡1.0 h后，煎煮3次，每次煎煮1.0 h，过滤，合并3次滤液，浓缩至500 mL，得浓度为5 g生药/mL的兰香草水煎液，密封冷藏，备用。

1.5 急性毒性试验 根据参考文献[13]，取60只小鼠，雌雄各半，随机分为6个组，每组10只，给药前禁食不禁水12 h，根据预试验，确定引起0%动物死亡的最小剂量(Dn)和100%动物死亡的最大剂量(Dm)的致死量范围。在此范围内，组间剂量比值按1∶0.8进行试验，各组的剂量分别为65.60、82.00、102.40、128.00、160.00、200.00 g生药/(kg·bw)，以最大限度0.4 mL/(10 g·bw)灌胃给药1次后，自由饮食，连续观察14 d，记录小鼠活动情况及毒性反应情况，并对死亡小鼠尸体进行剖检，观察其内脏器官的变化情况。采用改良寇氏法计算小鼠的半数致死量(LD50)和95%置信区间。

1.6 止血试验

1.6.1 对小鼠凝血时间(CT)的影响 根据参考文献[13-14]，取50只小鼠，雌雄各半，随机分为5个组，每组10只，即空白对照组(等体积的生理盐水)、阳性对照组[云南白药0.33 g/(kg·bw)]、兰香草水煎液高剂量组[25.6 g生药/(kg·bw)]、兰香草水煎液中剂量组[12.8 g生药/(kg·bw)]、兰香草水煎液低剂量组[6.4 g生药/(kg·bw)]，各组每日灌胃给药1次，给药容积为0.2 mL/(10 g·bw)，连续灌胃7 d。末次给药1 h后，用内径为0.9～1.1 mm、厚度为0.10～0.15 mm的毛细管从小鼠眼内眦部刺入，使血液自行流出，弃去第1滴血，再分别将血液滴于清洁载玻片的两端，血滴直径5 mm，立即开始计时，此后每隔30 s用干燥针头挑动血液1次，至针头能挑起纤维蛋白丝为止。从采血开始至挑起血丝止，所历时间即为凝血时间(CT)。凝血时间缩短率/%=(空白对照组平均凝血时间-给药组平均凝血时间)/空白对照组平均凝血时间×100%。

1.6.2 对小鼠出血时间(BT)的影响 根据参考文献[13-14]，按照“1.6.1”项的分组及给药方法。末次给药1 h 后，于小鼠尾尖约 3 mm处标记，用手术刀片在鼠尾标记处横向切断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30 s用滤纸吸去血滴1次，直至血液自然停止为止，所历时间即为出血时间(BT)。出血时间缩短率/%=(空白对照组平均出血时间-给药组平均出血时间)/空白对照组平均出血时间×100%。

1.7 抗炎试验

1.7.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 根据参考文献[13，15-16]，按照“1.6.1”项的分组及给药方法，以地塞米松[5.0 mg/(kg·bw)]为阳性对照组。末次给药45 min 后，于小鼠右耳正反两面滴二甲苯20 μL/只致炎，致炎15 min 后处死小鼠，于左右耳相同的部位用8 mm打孔器打下圆耳片，精密称重，左右耳片的重量差为耳肿胀度。耳肿胀抑制率/%=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。

1.7.2 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响 根据参考文献[13，15]，按照“1.6.1”项的分组及给药方法，以地塞米松[5 mg/(kg·bw)]为阳性对照组。末次给药1 h后，每只小鼠右足跖皮下注射1%角叉菜胶0.05 mL，4 h后沿踝关节切下左右足，精密称重，左右足的重量差为足跖肿胀度。足跖肿胀抑制率/%=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。

1.8 镇痛试验

1.8.1 对小鼠热板致痛反应的影响 根据文献[14-15,17]，将小鼠置于(55±0.5)℃的智能热板仪上，记录小鼠足底接触热板至出现舔后足所需时间，即为该小鼠痛阈值。筛选痛阈值在5～30 s的合格小鼠40只，每组8只，按照“1.6.1”项的分组及给药方法，以阿司匹林[0.5 g/(kg·bw)]为阳性对照组。于给药前测定各组小鼠正常痛阈值作为给药前痛阈值，于末次给药1 h后测定小鼠舔后足时间为给药后痛阈值。痛阈提高率/%=(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值×100%。

1.8.2 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 根据参考文献[15,17]，按照“1.6.1”项的分组及给药方法，以阿司匹林[0.5 g/(kg·bw)]为阳性对照组。末次给药1 h后，每组小鼠腹腔注射 0.6% 醋酸溶液10 mL/(kg·bw)。观察并记录小鼠注射冰醋酸后15 min内扭体反应次数。扭体抑制率/%=(空白对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/空白对照组平均扭体次数×100%。

2 结果

2.1 兰香草水煎液的急性毒性试验 小鼠灌胃给药1 d后，部分出现反胃、进食减少、自主活动减少、蜷曲、呼吸减慢等症状，无小鼠死亡。第2天后小鼠陆续出现死亡，14 d后无小鼠死亡。死亡小鼠剖检观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠等内脏器官，未见出血、坏死等病变。根据改良寇氏法计算，兰香草水煎液的LD50=126.73 g生药/(kg·bw)，LD50的95%置信区间为117.39～136.07 g生药/(kg·bw)，结果见表1。

表1 急性毒性检测

2.2 对小鼠凝血时间(CT)的影响 结果如表2所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高、中、低剂量组均能显著缩短小鼠凝血时间(P<0.01)。其中，低剂量组的效果略优于高、中剂量组。

表2 小鼠凝血时间(CT)检测

2.3 对小鼠出血时间(BT)的影响 结果如表3所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高、中、低剂量组均能显著缩短小鼠出血时间(P<0.01)。其中，中剂量组效果优于阳性对照组和高、低剂量组。

表3 小鼠出血时间(BT)检测

2.4 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 结果如表4所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高、中、低剂量组均能显著降低二甲苯所致小鼠耳肿胀程度(P<0.05或P<0.01)，且存在明显的量效关系，即给药剂量越大，作用越强。其中，高剂量组的肿胀抑制率稍优于阳性对照组。

表4 二甲苯致小鼠耳肿胀检测

2.5 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响 结果如表5所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高剂量组能显著降低由角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀程度(P<0.01)，且兰香草水煎液各剂量组间存在明显的量效关系。其中，高剂量组的肿胀抑制率高于阳性对照组。

表5 小鼠足趾肿胀检测

2.6 对小鼠热板致痛反应的影响 结果如表6所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高剂量组能显著降低小鼠热板致痛反应(P<0.05)，且兰香草水煎液各剂量组间存在明显的量效关系。

表6 小鼠热板致痛反应试验结果

2.7 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 结果如表7所示，与空白对照组比较，兰香草水煎液高、中、低剂量组能显著减少醋酸致小鼠扭体次数(P<0.05或P<0.01)，且存在明显的量效关系。

表7 小鼠扭体反应试验结果

3 讨论

目前，有关兰香草及其复方制剂的相关研究报道甚少，尤其是药理研究方面。因此，本试验对兰香草水煎液进行急性毒性反应以及止血、抗炎、镇痛活性研究。在急性毒性试验中，通过测定兰香草水煎液的LD50，筛选出安全、有效剂量，为其临床安全用药提供科学依据。试验结果显示，兰香草水煎液的LD50为126.73 g生药/(kg·bw)，根据其LD50可确定止血、抗炎、镇痛试验的给药剂量，其中，高剂量取LD50的1/5，中剂量取LD50的1/10，低剂量取LD50的1/20，在一定剂量范围内研究该药材的止血、抗炎、镇痛作用是安全有效的。

机体正常止血与凝血机制与血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纤溶系统及其相互之间的生理性调节和平衡息息相关。在止血试验中，通过玻片法测定小鼠凝血时间和断尾法测定小鼠出血时间来评价兰香草水煎液的止血活性。结果表明，兰香草水煎液可显著缩短小鼠凝血时间和出血时间，但不存在剂量依赖关系；在凝血时间测定中发现，低剂量组要略优于高、中剂量组，而出血时间测定中发现，中剂量组优于阳性对照组(云南白药)和高、低剂量组。

急性炎症或炎症早期主要表现是毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿，本试验通过二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶所致小鼠足肿胀建立2种常用的急性炎症模型。结果表明，兰香草水煎液可显著抑制致炎物质诱发的急性炎症反应，高剂量组优于阳性对照组(地塞米松)，且作用效果与剂量呈正相关。

机体在受到内、外环境刺激后，致痛物质(比如缓激肽、组胺、前列腺素等)从组织中产生并释放，兴奋伤害疼痛感受器或使其致敏，导致疼痛。本试验采用小鼠热板致痛法和醋酸致扭体法2种常用致痛模型测定镇痛活性。结果表明，兰香草水煎液可明显减轻小鼠疼痛反应，且作用效果与剂量呈正相关。另外，笔者曾采用吲哚美辛作为阳性对照药，发现给药后小鼠逐渐消瘦死亡，预试验结果亦不理想。之后改用阿司匹林，给药后小鼠饮食、活动、体重等方面均正常，且镇痛效果明显。故最终选用阿司匹林作为阳性对照药。

综上，兰香草水煎液毒性小，具有较好的止血、抗炎、镇痛作用。但其发挥药效的物质基础及作用机理尚不明确，有待进一步研究。