脉动真空灭菌器对防护服的灭菌效果观察

孙世雄 ， 樊晓旭 ， 田莉莉 ， 孙明军 ， 徐 毅 ， 孙淑芳

(1. 中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东 青岛 266114 ； 2. 青岛市计量技术研究院 ， 山东 青岛 266000)

压力蒸汽灭菌器是实验室生物安全的关键防护设备之一[1]。其中，脉动真空灭菌器利用机械抽真空的原理，使灭菌器内形成负压，蒸汽得以迅速穿透物品内部，利用蒸汽释放的潜热灭菌[2]。因其具有蒸汽穿透力强、灭菌效果可靠、灭菌时间短等优点，被生物安全三级实验室广泛使用。但是在实际工作中，由于包装不同、装载量不同、排空方式不同，灭菌效果存在较大差异[3-5]。本试验针对前期存在的防护服灭菌不合格的情况调整灭菌程序，并综合运用物理、化学、生物监测法对新改的灭菌程序的有效性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料 脉动真空灭菌器(山东新华 XG1.D，设定压力为相对压力)；7件医用一次性防护服(邦维高科 S8)；灭菌袋(Thermo Fisher 01-828D，聚丙烯材质)；不锈钢网状球(直径10.8 cm)；包内化学指示卡(3M 1243A)；生物指示物(福泽爱斯 H3723T)。电热恒温培养箱(博迅HPX-9162 MBE)；温度压力测定仪(意大利TECNOSOFT，所测压力为绝对压力)。

1.2 方法 取7件新的防护服，抖开后，依次放入灭菌袋，将包内化学指示卡、生物指示物和温度压力探头放入不锈钢网状球，然后将不锈钢网状球裹在最中间的那件防护服里面。将灭菌袋的袋口扎起来，并留出直径约2 cm的小孔，放入灭菌器。此外，灭菌器内裸露放置包内化学指示卡、生物指示物和温度压力探头作为对照。分别运行调整前和调整后的灭菌程序。调整前的灭菌程序：排空3次(上限80 kPa、下限0 kPa)、温度132 ℃、时间10 min。调整后的灭菌程序：脉动3次(上限80 kPa、下限-80 kPa)、温度132 ℃、时间10 min。

程序运行结束后，撕开或用刀剖开防护服，取出指示物和温度压力探头。观察包内化学指示卡黑色条带的爬行情况，若黑色条带爬至“ACCEPT”区域,则灭菌合格；反之，则灭菌失败。挤破生物指示物内含的安瓿，培养液浸润菌片，56 ℃培养48 h，若培养液保持紫色，则灭菌合格；若培养液变黄，则灭菌失败。只有2种指示物都指示合格，才能判定灭菌合格。此外，读取温度压力探头的记录数据，分析温度、压力的变化情况。

2 结果

2.1 防护服灭菌后的变化 调整前的灭菌程序运行结束后，灭菌单元的体积缩小至原来的约1/2，灭菌袋与防护服、防护服与防护服之间没有紧密粘连，徒手就能将其撕开。调整后的灭菌程序运行结束后，灭菌单元的体积缩小至原来的约1/3，灭菌袋与防护服、防护服与防护服紧密的粘连在一起，用刀才能将其剖开。

2.2 指示物指示结果 灭菌程序调整前、调整后的对照皆成立。调整前的灭菌程序运行结束后，防护服内的包内化学指示卡的观察区完全没有黑色条带出现，生物指示物在培养48 h后变为黄色。调整后的灭菌程序运行结束后，防护服内的包内化学指示卡的观察区爬满黑色条带，生物指示物在培养48 h后保持紫色(表1)。

表1 指示物指示结果

2.3 温度压力数据分析 灭菌程序调整前，经过排空、升温，灭菌器12:20:58进入灭菌阶段，12:38:58结束，实际灭菌18 min。防护服外(即灭菌器内室)的温度稳定在132.06～134.81 ℃，平均温度为133.59 ℃。防护服中心部位的温度不断上升，最低57.33 ℃，最高93.49 ℃，平均温度为81.00 ℃，远低于设定值和防护服外的温度。因为该试验是在灭菌器运行完1个程序后进行的，因此防护服内外的初始温度都较高(图1)。

图1 灭菌程序调整前防护服内外温度变化曲线

灭菌程序调整后，经过预热、脉动和升温，灭菌器11：44：37进入灭菌阶段，11：59：37结束，实际灭菌15 min。防护服外的温度稳定在133.15～134.63 ℃，平均温度为133.96 ℃。防护服中心部位的温度稳定在131.13～133.61 ℃，平均温度为132.87 ℃，比防护服外的平均温度低1.09 ℃。防护服内的温度11:45:37达到设定值，延迟1 min(图2)。

图2 灭菌程序调整后防护服内外温度变化曲线

灭菌程序调整前，防护服内外的压力波动高度一致。灭菌阶段防护服外的压力稳定在288.30～314.68 kPa，平均压力为303.59 kPa。防护服中心部位的压力稳定在288.69～311.94 kPa，平均压力为302.83 kPa(图3)。

图3 灭菌程序调整前防护服内外压力变化曲线

灭菌程序调整后，防护服内外的压力波动基本一致，防护服内的压力变化存在一定滞后。灭菌阶段防护服外的压力稳定在294.13～312.41 kPa，平均压力为303.99 kPa。防护服中心部位的压力稳定在294.38～310.75 kPa，平均压力为304.34 kPa。第2、3次脉动时，防护服内外的压力存在大的差异，防护服内的脉动深度较浅(图4)。

图4 灭菌程序调整后防护服内外压力变化曲线

3 讨论

根据《医疗废物管理条例》和《国家危险废物名录》，生物安全三级实验室使用后的医用一次性防护服属于感染性医疗废物，划归危险废物(代码为831-001-01)[6]，在移交医疗废物集中处置单位前应对其就地消毒，但是，对其操作没有具体、实用的标准或规范。各实验室在灭菌器、装载量、包装材料、封口方式、灭菌程序和验证方法等的选择上不尽相同，存在安全隐患。如果灭菌不彻底，将对环境、实验人员、医疗废物集中处置人员等造成不良影响。

《实验室设备生物安全性能评价技术规范》(RB/T 199—2015)提到，指示物应置于待灭菌物品包内中心部位[7]。但是在实际工作中，防护服不同于镊子、手术刀、锐器盒等污染物，灭菌后粘为一体，想要剖开，取出中心部位放置的指示物并非易事，而且存在安全风险。因此，实验室可以定期进行实物模拟，确定特定灭菌程序对特定灭菌物品灭菌的有效性。

灭菌程序调整前后，排空方式不同(脉动是排空的一种)，灭菌效果天差地别。主要原因在于调整后的排空方式(上限80 kPa、下限-80 kPa)相比于调整前的排空方式(上限80 kPa、下限0 kPa)，具有更彻底的冷空气排除效果，进而为饱和蒸汽的快速、充分渗入提供了条件。调整后的灭菌程序包括7个阶段：预热、脉动、升温、灭菌、排汽、干燥和回空。在预热、脉动和升温阶段，受灭菌袋和防护服层层阻隔的影响，防护服中心部位的温度和压力的变化，存在不同程度的延迟和减弱。但是在灭菌阶段，防护服内外的温度、压力的一致性较好。防护服内比防护服外达到设定温度的时间延迟1 min。但是，这些改变并未影响到灭菌效果。

在调整后的灭菌程序的灭菌阶段，防护服内的平均温度比防护服外的平均温度低1.09 ℃的原因，可能与聚丙烯包装袋有关。该包装袋虽然具有良好的导热性，但是不透气，加之袋口仅开了1个直径约2 cm的小孔，既不利于包内冷空气的排除，又不利于包外热蒸汽的渗入[8-9]。因此，在做好个人防护的情况下，可以考虑将灭菌袋的袋口再适当开大一点。此外，病原微生物实验室可以借鉴医院消毒供应中心对包装的要求，采用透气性好的材料对防护服进行包装[10]。

为贯彻《中华人民共和国传染病防治法》、《中国人民共和国动物防疫法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》等法律、法规，加强对高致病性病原微生物实验室污染物排放的控制和管理，前环境保护部组织起草了我国第一部高级别生物安全实验室废弃物处置的国家标准——《高致病性病原微生物实验室污染物排放标准》，并于2006年、2010年公开征求意见，但是至今未发布[11]。为确保感染性生物因子的“零排放”，建议对灭菌方法的选择、设备的管理、程序的适用和效果的验证作出详细规定。此外，针对防护服、锐器盒和玻璃瓶等不易灭菌的医疗废物，以及病料、研磨管、培养皿和菌毒培养液等危险废物，要有具体可行的灭菌手段、排放要求和监管举措。