丹参促进人羊膜间充质干细胞增殖的实验研究

史恒瑞，董 平

(1.杭州市丁桥医院 口腔科，浙江 杭州 310022；2.遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563000)

颌面部位于身体表面，遭遇车祸、外力击打后易受到损伤，影响咀嚼等生理功能，如有面部外形改变亦会导致心理创伤。随着研究的进展，组织工程为修复颌面部组织缺损提供了新的选择。人羊膜间充质干细胞(hAMCs)存在于孕妇产后分娩出的胎盘中，可以分化成来自三个胚层的所有细胞，这些细胞可用来修复颌面部的各类组织缺损。同时，hAMCs具有较强的增殖能力，且较易获取，并具有低免疫原性，异体移植不易引起免疫排斥反应。通过以上特点可预见，该细胞在组织工程修复与重建及细胞替代治疗等再生医学研究领域中具有广阔的应用前景。但hAMCs也存在着一些缺陷，尤其在体外培养时，生长速度缓慢、传代代数有限。所以，如何能高效地扩增人羊膜间充质干细胞就显得尤为重要。

现代药理学证实丹参有强心、扩血管、抗血栓形成、改善微循环、促进组织再生与修复等良好的作用，其有效成分如丹酚酸、丹参酮都具有抗氧化、降低生物体内氧自由基水平的药理作用。已有多篇文献证实，在体外培养间充质干细胞时给予其类似于体内的低氧环境后，间充质干细胞会保持较原始的状态，增殖能力则会大大增强。基于上述的研究成果及观点，本研究观察丹参是否具有促进hAMCs增殖的能力，为将来更好地将hAMCs应用于组织工程及再生医学中提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人羊膜来源于遵义医科大学附属医院妇产科，经伦理审核、产妇知情同意后，在无菌的条件下从健康足月剖宫产的产妇分娩的胎盘中采集羊膜，将采集到的羊膜置于装有洁净的PBS溶液的玻瓶中，并在2 h内进入实验的流程。

1.2 主要实验试剂 胰蛋白酶、胎牛血清、L-DMEM，均来自Gibco(USA)；胶原酶Ⅱ、L-谷氨酰胺、鼠抗人波形蛋白抗体，购自Sigma(USA)；CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD166-PE、CD73-PE、CD44-PE，购自BD(USA)；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基(中国)；丹参冻干粉购自哈药二厂(中国)；SDS-PAGE电泳液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Western转膜液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液，均购自碧云天(中国)。

1.3 人羊膜间充质干细胞的分离和培养 无菌条件下取孕期为38～40周剖宫产或自然顺产后的人胎盘，机械剥离胎盘羊膜组织，参照相关研究分离获得人羊膜间充质干细胞。在倒置显微镜下观察细胞生长情况，当原代细胞生长所占的面积占到培养瓶底壁的80% 时传代，第3代时进行人羊膜间充质干细胞的鉴定。

1.4 人羊膜间充质干细胞的鉴定

1.4.1 免疫表型鉴定 取第3代细胞，进行细胞计数，至少选取1×10个细胞，在暗室中分别加入5 μL 荧光标记单抗至不同的上机管中，同型对照为相应荧光标记的小鼠IgG-FITC、IgG-PE，每管加入已制备好的细胞悬液100 μL至上述上机管，室温下避光孵育30 min，PBS洗涤后重悬细胞，加入4%多聚甲醛固定细胞，流式细胞仪上机检测。

1.4.2 免疫细胞化学染色检测 取第3代细胞爬片两张，按照试剂盒说明操作，将细胞爬片分为实验组及对照组，实验组滴加波形蛋白抗体室温孵1 h，对照组滴加PBS液代替一抗，两组的孔内均滴加鼠兔通用型二抗，经室温下孵育、DAB显色、苏木素复染等操作后待玻片自然干燥置于显微镜下观察并拍照。

1.4.3 Western Blot检测波形蛋白表达 以上皮细胞及间质细胞作为对比，取第3代人羊膜间充质干细胞加入蛋白裂解液抽取细胞总蛋白，将定量好的总蛋白按体积比4∶1加入上样缓冲液，煮沸5 min，置于-20 ℃冰箱内。取蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%分离胶)，加入5 μL蛋白分子量标准参照物以确定所检测蛋白带的位置。电泳的起始电压为80 V，待样品至分离胶时提高电压至100 V，指示剂至凝胶底部时停止电泳；再于电转仪上在330 mA、90 min下将蛋白样品湿转到PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶PBST封闭1 h，分别加入稀释后的一抗，4 ℃置于摇床过夜，室温下孵育1∶2 000的二抗1.5 h，洗膜3次，用化学发光成像系统显影，拍照后进行灰度值分析。

1.5 MTT法检测细胞增殖情况 取第4代细胞沉淀，计数后平分为A、B、C三组，分别加入含0.05%丹参的全培养基、含0.005%丹参的全培养基、全培养基，将细胞种于96孔板中并设置空白对照D组，每48 h换液1次，测试时加入预先配制好的MTT，之后在CO培养箱中孵育4 h，无菌条件吸除孔内的液体，加入100 μL的DMSO，置于酶标仪中再测定每组的OD值。所得数据为药物干预细胞生长后第1天的OD值，之后每24 h测定一次并绘制7天内的生长曲线。

1.6 细胞周期测定 取第4代细胞沉淀，按MTT法检测细胞增殖情况时的方法进行细胞分组并种瓶，每48 h换液，待各组细胞在培养瓶内长满后，制取细胞悬液并保证悬液中所含有的细胞大于1×10，加入同体积的阻止培养基，在4 ℃、1 000 r/min下离心5 min，倒掉上清，PBS洗涤细胞，冰乙醇固定细胞，PBS洗去固定液后，每组加入100 μL的牛胰核糖核酸酶，37 ℃水浴30 min，400 μL的碘化丙啶染色混匀，4 ℃避光孵育后，流式细胞仪采集各组细胞检测，Cellqust软件分析各组细胞周期计算增殖指数(proliferation index, PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.7 实验组细胞免疫表型鉴定 获取第5代人羊膜间充质干细胞，加入含0.05%丹参的全培养基，待细胞长满后，按1.4.1方法检测该组细胞CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166的表达情况，并与鉴定细胞时的结果做对比。

2 结果

2.1 人羊膜间充质干细胞形态及鉴定 原代镜下可见细胞贴壁生长，呈长条形、梭形或角形。随着传代及生长，细胞形态呈长梭形更为明显并呈漩涡状生长(封三图1)。第3代hAMCs高表达：CD44、CD73、CD29、CD166；低表达：CD34、CD45(表1)。所制取的细胞波形蛋白阳性表达，细胞胞浆呈棕褐色(封三图2A)，空白对照组则未见明显表达(封三图2B)。Western Blot法显示，羊膜中所提取的细胞高表达波形蛋白(Vimentin)、低表达E钙黏连蛋白(封三图3)，组间比较差异有统计学意义(<0.05)。综合以上结果可以说明所获取的细胞为人羊膜间充质干细胞。

2.2 不同浓度丹参促增殖的影响 各组细胞生长曲线显示(图1)，在第4～6天时，各组细胞处于对数生长期，A、B两组OD值高于C组，差异具有统计学意义(<0.05)。计算细胞倍增时间(doubling time，Td)：Td=t×lg2/(lgNt-lgN)。A、B、C组细胞倍增时间分别为72.24 h、84 h、99.12 h，A、B两组低于C组，差异具有统计学意义(<0.05)。细胞周期检测结果显示，A、B两组细胞的G2/M、S期比例高于C组，G0/G1期比例低于C组，A、B、C组PI分别为(60.75±0.68)%、(15.7±0.95)%、(6.64±0.96)%，A、B组高于常规对照组，差异具有统计学意义(<0.05)，见图2。实验组第5代细胞流式术结果表明细胞高表达：CD44、CD73、CD29、CD166，低表达：CD34、CD45。将该结果与常规培养基组的细胞流式结果做对比，结果显示：除CD166外，其余CD分子间的表达率差异均无统计学意义(>0.05)，见表1。

图1 各组细胞生长曲线Figure 1 The cell growth curve

图2 各组细胞的细胞周期变化对比Figure 2 The contrast of each cycle changes

表1 流式细胞术分析及对比

3 讨论

人羊膜间充质干细胞自发现以来，因取材方便、来源广泛且产量丰富、增殖能力较骨髓间充质干细胞强、免疫原性低、多向分化潜能、几乎不存在伦理学争议等特点，已经展现出较其他干细胞巨大的优势，这些优势均提示其有可能成为组织工程学及细胞替代治疗中理想的种子细胞。但是，间充质干细胞在体外扩增时，易发生增殖数量少、细胞衰亡的现象。为了延缓间充质干细胞的衰老并保持其较强的增殖能力，人们做了大量的研究。有文献报道：将β-catenin-绿色荧光蛋白重组腺病毒扩增后，转染人羊膜间充质干细胞可提高其增殖能力，但此法费用较高，且步骤较繁琐，不利于大规模应用。除此之外，有学者将碱性成纤维细胞生长因子加入到培养基中，发现该法可促进人羊膜间充质干细胞的增殖。也有文献表明该法虽可促进间充质干细胞增殖，但会导致细胞向成纤维细胞分化。因此，寻找一种费用低且效果好的方法来促进人羊膜间充质干细胞增殖有研究意义。

氧化应激是指生物、细胞体内出现大量的活性氧(ROS)、氧自由基团，过量的氧自由基团可引起组织、细胞和机体不同程度的受损，这种损害主要是通过NADPH氧化酶途径和线粒体电子传递链途径造成的。基于上述理论，只要干细胞培养环境中有足够的抗氧化剂，清除不利于细胞生长的氧自由基团，从而维持氧化还原平衡就可以维持其较原始的特性，增加其存活概率。针对该设想，目前有研究证实，在体外培养间充质干细胞时将其置于低氧的环境中能减少细胞内活性氧自由基的生成，维持其较强的活性及较为原始的状态。另有文献表明：给予细胞抗氧化剂后，骨髓间充质干细胞可以维持较高的增殖能力及多向分化潜能。

有文献表明丹参所含的丹参酮及丹酚酸类成分具有抗氧化、降低生物体内氧自由基水平、抗氧化应激反应等药理作用，丹参作为传统中药材，其产量大且价格低。所以，本研究试验性地在常规培养基中加入适量的丹参，观察细胞生长状况，结果显示，所获取的第三代细胞高表达波形蛋白及CD44、CD73、CD29、CD166，低表达CD34、CD45，这个结果符合国际细胞治理协会设立的人羊膜间充质干细胞表型特征的标准。本研究结果说明培养基中加入适量的丹参对人羊膜间充质干细胞的增殖具有促进作用，可以干预人羊膜间充质干细胞的细胞周期变化，这个变化至少在短期内是存在的。然而由于各种因素限制，本实验只是选择加入0.05%和0.005%的丹参于培养基中，未能尝试更多的加药浓度，所以本实验只能说明0.005%～0.05%这个浓度范围对增殖有促进作用，未能完全探明该药物的有效浓度范围，这需要后续大量的实验去探明。除此之外，经过药物促增殖后的细胞多向分化能力、关键基因的表达及免疫源性有无改变等问题，需要进一步的实验研究。