不同添加方式的酸化剂对肉鸡生长性能和肠道发育的影响

沈一茹 钟 光 胡 艳 张 珊 燕 磊 施寿荣*

(1.中国农业科学院家禽研究所，扬州 225125；2.新希望六和饲料股份有限公司，青岛 266100)

作为抗生素替代品，酸化剂已被广泛应用于动物饲料中，因其可有效提高动物的消化道适应能力和肠道健康，已成为一种高效、无污染、无残留的替代促生长型抗生素的保健型饲料添加剂[1-2]。在家禽生产中合理使用酸化剂，可通过抵御细菌的侵入来维护禽类的肠道健康，进一步提高其生长性能[3]。已有多项研究证实，饮水中添加酸化剂可通过改善盲肠微生物区系、提高消化酶活性，从而提高肉鸡对饲料中养分的利用率，改善其生长性能[4-5]；此外，在蛋鸡生产中添加饮水型酸化剂，可显著降低蛋鸡的死亡率，并促进蛋黄的沉积[6]。饲粮中添加饲料型酸化剂，可调节肉鸡的胃肠道酸碱平衡，提高采食量，进而促进其生长性能；改善夏季蛋鸡鸡蛋的新鲜度，提高其抗氧化能力[7]。目前，对于家禽饲粮中酸化剂的使用研究均集中于单一添加方式酸化剂对其生长性能的影响，较少有研究比较相同的酸化剂在不同添加方式下对肉鸡生长性能和肠道发育的影响。因此，本试验通过饮水添加和饲粮添加2种不同酸化剂添加方式，比较其对肉鸡生长性能和肠道发育的影响，以期为酸化剂在肉鸡生产中的高效使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲养管理

选用1日龄、体重相近的健康白羽肉鸡512只，随机分为4组，每组8个重复，每个重复16只鸡。正常对照组(normal control group，NC组)饲喂基础饲粮和基础饮用水；阳性对照组(positive control group，PC组)饲喂基础饲粮+20 mg/kg维吉尼亚霉素和基础饮用水；饮水酸化剂组(water acidifier group，WA组)饲喂基础饲粮，基础饮用水中酸化剂添加量为0.1%，添加方式为每日定量混入基础饮用水中；饲粮酸化剂组(feed acidifier group，FA组)饲喂基础饲粮+0.2%酸化剂和基础饮用水，用酸化剂替代基础饲粮中等量的玉米。基础饲粮为玉米-豆粕型颗粒料，参照NRC(1994)鸡的营养需要，按1～21日龄和22～42日龄2个阶段进行配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。每日监测各组饮用水pH，4组饮用水pH见表2。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

表2 4组饮用水pH

饲养试验在中国农业科学院家禽研究所试验基地进行，试验季节为春季，所有鸡只均在同一栋鸡舍内，采用地面平养的饲养方式，自由采食和饮水。7、14日龄分别接种新-传二联苗和法氏囊疫苗，21、28日龄分别饮水免疫新-传二联苗和法氏囊疫苗。试验期42 d。

1.2 试验材料

本试验用酸化剂主要成分为甲酸、甲酸铵、乙酸、丙酸和山梨酸复合组成。酸化剂和维吉尼亚霉素均由荷兰某国际集团提供。

1.3 样品采集

分别于21和42日龄，每个重复选取1只接近平均体重的肉鸡，剖开腹腔，在每只鸡的相同部位取同样长度的十二指肠、空肠和回肠组织，迅速置于多聚甲醛(4%)溶液中用于制作组织切片；用冰浴的生理盐水冲洗肠腔，用冲洗过的载玻片刮取肠黏膜，置于冻存管中，迅速投入液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存，用于基因表达测定。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能

试验从开始到结束，观察、记录鸡群的健康状况及临床变化，记录鸡只的摄食和死亡情况，统计各组鸡只的死亡数，计算死亡率(mortality)。分别在1、21、42日龄称取各组鸡只的体重，称量前禁食12 h，计算各组鸡只在1～21日龄、22～42日龄、1～42日龄阶段的平均日增重(ADG)。统计每个阶段各组的投料量，计算各组鸡只在1～21日龄、22～42日龄、1～42日龄的平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。计算欧洲效益指数(European profit index，EPI)，计算公式为：

EPI=[(体重×成活率)/(料重比×

出栏日龄)]×10 000。

1.4.2 肠道形态

肠道切片使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法[8]，使用正置显微镜放大40倍进行观察，每张切片观察并量取10根有代表性的绒毛，量取不同肠段绒毛高度和隐窝深度，并计算绒隐比(V/C)，计算公式为：

绒隐比=绒毛高度/隐窝深度。

1.4.3 肠道杯状细胞数量

十二指肠、空肠和回肠组织采用高碘酸-无色品红染色法(periodic acid-schiff，PAS)[9]，每组内每张切片随机挑选3个视野放大100倍进行观察。拍照时应选取组织中有代表性的视野。应用Image Pro Plus软件，每个视野至少选取5根有代表性的绒毛，记录选取的绒毛中杯状细胞数量，计算1 000个上皮细胞内所含有的杯状细胞数量。

1.4.4 肠道紧密连接蛋白mRNA相对表达量

采用实时荧光定量PCR测定空肠黏膜中闭合小环蛋白-1(ZO-1)、密闭蛋白(Occuludin)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、封闭蛋白-2(Claudin-2)和封闭蛋白-3(Claudin-3)的mRNA相对表达量。总RNA的提取使用Trizol法进行提取，RNA纯度与浓度使用核酸检测仪(Beckman，美国)检测，使用试剂盒(TaKaRa，日本)对RNA进行反转录，cDNA留存待用。引物购于上海Invitrigen公司，引物序列见表3。使用10.0 μL反应体系，在实时荧光定量PCR仪(ABI，美国)进行测定。选择β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA相对表达量。

表3 引物序列

1.5 数据统计分析

数据使用SPSS 20.0进行统计分析，采用单因子方差分析(one-way ANOVA)检验组间差异显著性及影响效应，使用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著，0.05

2 结果与分析

2.1 不同添加方式的酸化剂对肉鸡生长性能的影响

由表4可知，与NC组相比，WA和FA组的欧洲效益指数分别提高了8.91%和10.84%(P<0.05)，且与PC组无显著差异(P>0.05)。与NC组相比，FA组的死亡率降低了66.60%(P<0.05)，料重比有降低趋势(P=0.089)，且与PC组无显著差异(P>0.05)；与WA组相比，FA组的死亡率降低了50.15%(P<0.05)，其他生长性能指标均无显著差异(P>0.05)。以上结果提示，酸化剂通过饮水添加和饲粮添加在促进肉鸡生长性能的作用上均可替代抗生素，但饲粮添加的效果优于饮水添加。

表4 不同添加方式的酸化剂对肉鸡生长性能的影响

2.2 不同添加方式的酸化剂对肉鸡肠道形态的影响

由表5可知，与NC组相比，WA和FA组的21日龄十二指肠隐窝深度分别降低了23.35%和30.84%(P<0.05)，21日龄十二指肠绒隐比分别提高了29.73%和33.28%(P<0.05)，且与PC组无显著差异(P>0.05)。与NC组相比，WA和FA组的42日龄十二指肠绒隐比分别提高了28.83%和27.62%(P<0.05)，且与PC组无显著差异(P>0.05)。以上结果提示，酸化剂通过饮水添加和饲粮添加均可有效提高肉鸡十二指肠的肠道发育，尤其是对肉鸡育雏期的作用效果明显。

表5 不同添加方式的酸化剂对肉鸡十二指肠形态的影响

由表6可知，与NC组相比，FA组的42日龄空肠绒隐比提高了27.83%(P<0.05)，且与PC组无显著差异(P>0.05)；WA组的空肠形态指标无显著差异(P>0.05)。以上结果提示，酸化剂通过饲粮添加在空肠的作用效果优于饮水添加。

表6 不同添加方式的酸化剂对肉鸡空肠形态的影响

由表7可知，与NC组相比，FA组的21日龄回肠绒隐比显著提高(P<0.05)，21日龄回肠隐窝深度有降低趋势(P=0.065)，且与PC组无显著差异(P>0.05)；WA组的回肠形态指标无显著差异(P>0.05)。以上结果提示，酸化剂通过饲粮添加在回肠的作用效果优于饮水添加。

表7 不同添加方式的酸化剂对肉鸡回肠形态的影响

2.3 不同添加方式的酸化剂对肉鸡肠道杯状细胞数量和紧密连接蛋白基因表达的影响

由表8可知，与NC组相比，FA组的21日龄十二指肠和空肠杯状细胞数量显著提高(P<0.05)，42日龄空肠杯状细胞数量显著提高(P<0.05)；WA和FA组的42日龄回肠杯状细胞数量有提高趋势(P=0.051)。以上结果提示，酸化剂通过饲粮添加对肠道杯状细胞数量的影响优于饮水添加。

表8 不同添加方式的酸化剂对肉鸡肠道杯状细胞数量的影响

由表9可知，与NC组相比，WA和FA组的21日龄空肠封闭蛋白-2的mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05)，FA组的21和42日龄空肠封闭蛋白-3的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。以上结果提示，酸化剂通过饮水添加和饲粮添加对早期肠道紧密连接蛋白的表达有促进作用，并优于抗生素。

表9 不同添加方式的酸化剂对肉鸡空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达的影响

3 讨 论

3.1 不同添加方式的酸化剂对肉鸡生长性能的影响

自2020年7月我国畜牧业饲料严格禁抗以来，多种饲料添加剂纷纷问世，包括益生菌、酶制剂、植物提取物和酸化剂等。这些添加剂因其功能不同，作用机制也不尽相同，但它们的最终目的都是替代饲料中促生长型抗生素的作用，以期在饲料无抗条件下保持动物的生长性能[10]。其中，酸化剂作为高效、无污染、无残留的添加剂在养殖业中广泛使用。本研究结果表明，不同添加方式的酸化剂可有效提高肉鸡的欧洲效益指数，与添加抗生素无显著差异，这与之前研究结果一致，即可通过降低肉鸡肠道pH[11]、减少肠道有害菌的增长[12]、提高其对饲料中营养物质的吸收利用率[13]等多个方面的作用有效提高肉鸡的生长性能[14]。本试验使用的酸化剂主要成分为甲酸及其铵盐，甲酸作为短链有机酸的一种，具有较强的抑菌杀菌能力，在市场上使用范围较广。过量添加甲酸则存在腐蚀性强和气味大等缺点，而适量添加甲酸及其铵盐能有效提高饲粮的适口性，促进采食，并使其在体内游离出甲酸，起到杀菌和降低胃肠道pH的作用。本试验结果表明，与饮水添加相比，酸化剂通过饲粮添加可显著降低死亡率，有降低全期料重比的趋势，其效果接近于添加抗生素，说明酸化剂通过饲粮添加对生长性能的影响优于饮水添加。本试验在饮用水中添加酸化剂后，饮水pH降至3.9左右。研究发现，饮水型酸化剂可通过降低脂肪酶活性和肠道有害菌数量来提高肉鸡的平均日增重和饲料转化率[15]。因此，本试验中酸化剂通过饮水添加也表现出较好的替抗效果，但偏酸性的水可能影响了饮水的适口性，进而导致其添加效果不如饲粮添加。另外，酸化剂通过饲粮添加除了以上效果外，还能够提高肉鸡肠道总蛋白酶和小肠蛋白酶活性[16]。本试验中，酸化剂通过饲粮添加的效果优于饮水添加，除了适口性的原因，推测可能与2种添加类型的酸化剂在肠道的停留时间有关，停留时间越久，其对肠道的作用效果越好，肠道的蛋白酶活性和吸收能力越强，进而表现出的生长性能越好。

3.2 不同添加方式的酸化剂对肉鸡肠道形态的影响

小肠是肉鸡消化道中消化和吸收饲料营养物质的主要部位，而肠道形态中的绒毛高度和隐窝深度则反映了饲料中营养物质与小肠的接触面积。绒毛增高，肠道吸收面积增加；隐窝变浅，肠上皮成熟率上升；肠道黏膜的绒隐比增加，可进一步表明肠道发育的完善和肠道吸收功能的增强[17]。本试验结果表明，酸化剂通过饲粮添加对肉鸡21和42日龄的十二指肠、空肠和回肠的肠道形态均有较优的改善效果，而饮水添加的改善效果集中于十二指肠，提示其主要作用于小肠前段。近年来多项研究报道，饲粮中添加酸化剂可有效增加十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度，降低隐窝深度，其对肠道形态改善的部位和程度根据所添加的酸化剂的水平和种类有不同程度的改变。不同种类的有机酸可以刺激肠道上皮细胞增生，并与肠道内的无机盐结合形成有机酸，提升肠道绒毛高度，增加肠道的有效吸收面积，进而提高生长性能[5, 18]。而近年来关于饮水中添加酸化剂的研究则主要报道其对肉鸡空肠的绒毛高度和隐窝深度的改善[15,19]，较少有报道其对小肠后段的有益影响[20]。以上研究与本试验结果相似，酸化剂通过饲粮添加对多个肠道形态均有改善作用，而饮水添加对肠道形态的作用范围较小。原因可能为酸化剂通过饲粮添加在肠道内移动过程缓于饮水添加，其作用时长和作用范围增加，进而表现出更优的肠道形态改善作用。酸化剂在肠道内制造的酸性环境可有效抑制有害菌对肠道黏膜的侵害，减少饲料在肠道内的发酵，降低食糜黏度，增强其可消化性，有利于肠道黏膜的生长，减少损伤[21]。另有研究表明，与未添加酸化剂的肉鸡相比，饮水中添加0.25%的有机酸可降低肉鸡肠道的pH、粪便水分和十二指肠的食糜黏度[22]，而饲粮中添加0.25%的有机酸也可显著降低十二指肠的肠道pH和食糜黏度[23]，但未有报道比较2种添加形式之间的肠道pH和食糜黏度的区别。

3.3 不同添加方式的酸化剂对肉鸡肠道杯状细胞数量和紧密链接蛋白表达的影响

广泛分布于小肠上皮细胞之间的杯状细胞是肠道屏障的重要指标之一。杯状细胞可形成分泌大量的黏蛋白，释放进入肠道后可成为润滑性的黏液涂布于上皮表面，保护上皮细胞形成肠道完整性和健康的第1道屏障[24]。肠道屏障的紧密连接则是一个高度动态的屏障结构，可通过调节细胞之间的通透性而选择吸收水分、离子及营养物质。肠道的紧密连接蛋白的完整性则对肠道上皮细胞之间的连接和维持肠道上皮的完整性方面发挥了重要的作用[25]。因此，肠道的杯状细胞数量和紧密连接蛋白可以作为肠道屏障功能和肠道发育的重要评判指标。酸化剂的添加可增加肉鸡肠道中短链脂肪酸含量，短链脂肪酸在肠道内不仅可作为营养物质供能，更能调控肠道的细胞代谢[26]。本试验结果表明，不同添加方式的酸化剂均有提高回肠杯状细胞数量的趋势，但酸化剂通过饲粮添加可显著提高肉鸡空肠杯状细胞数量，其效果优于添加抗生素。研究表明，酸化剂对仔猪杯状细胞的促生长作用等于甚至优于抗生素[27]，与本试验结果一致。有报道称酸化剂可提高禽类的免疫功能[28]，而抗生素则会影响动物肠道免疫细胞的动态平衡[29]，导致肠道菌群紊乱，证明酸化剂对肠道屏障的作用优于抗生素。进一步对肉鸡空肠黏膜的紧密连接蛋白表达进行测定发现，酸化剂通过饲粮添加可显著提高肉鸡空肠封闭蛋白-3的mRNA相对表达量，以上结果与肠道形态结果相对应。研究表明，酸化剂可通过提高猪的小肠上皮细胞肠道紧密连接蛋白含量来修复肠道损伤，进一步加强细胞间紧密连接，增强肠黏膜的屏障供能[30-31]。

以上结果说明，酸化剂可通过提高肠道紧密连接蛋白表达和杯状细胞数量来提高肉鸡肠道的屏障功能，而酸化剂通过饲粮添加则可进一步放大这种优化功能，使肉鸡的肠道发育优于饮水添加。

4 结 论

① 酸化剂通过饲粮添加和饮水添加对肉鸡生长性能的促进作用与抗生素相当，对肠道发育的促进作用优于抗生素。

② 酸化剂通过饲粮添加对肉鸡生长性能和肠道发育的改善作用优于饮水添加。