黄连解毒汤及其模拟组合调节高血脂症模型小鼠血脂代谢的初步研究

张连军，莫 鸣，李 博，张启春

（1.江苏省荣军医院 药剂科，江苏 无锡 214035；2. 南京中医药大学 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省植物药深加工工程研究中心，江苏 南京 210023）

中药组合筛选思路是借鉴组合化学的方法，将中药复方药效物质的基本构造单元，在中医药理论的指导下，通过配伍比例的优化整合，筛选药效物质的最优化，探讨中药复方的物质基础和机制；其理念与组合药物的思路有交叉，也和中药方剂的配伍密切相关[1-2]。引入组合筛选的研究思路，能够逆向思维、化繁为简，通过中药复方中不同药物组合以及药效物质单元（含有效部位、组分、成分）[3]组成的简单组合体系研究，逐步过渡到复方的复杂体系，不断挖掘各组分间更深层次的网络关系。在对中药及其复方没有完全认知的前提下，可为中药复方研究提供更多的探索方法。

近年来，黄连解毒汤在血脂代谢方面的研究逐步受到关注，通过加减方、拆方等研究证实了黄连解毒汤对高血脂模型小鼠胆固醇和甘油三酯均有明显的降低作用。临床研究的结果也表明黄连解毒汤对高血脂的调节效果不亚于辛伐他汀，且安全性较高，对肝肾功能无明显损害[4-5]。生物碱类、黄酮类、环烯醚萜苷类是黄连解毒汤中主要的三大类成分，而三大类成分中含量较高的分别为小檗碱、黄芩苷和栀子苷。有观点认为小檗碱本身具有良好的血脂代谢调节作用[6]，那么黄连解毒汤复方中增加小檗碱含量是否有利于提高显著疗效，同时对复方中其它组分的溶出与吸收有何影响？黄芩苷含量变化对复方中的小檗碱会产生怎样的影响？栀子苷在复方中对调节血脂有何作用？本研究参考黄连解毒汤及其成分模拟组合对脑缺血大鼠药动学研究的配制方法[7-8]，通过小檗碱、黄芩苷和栀子苷组成的黄连解毒汤模拟体系，探讨小檗碱、黄芩苷和栀子苷含量变化对黄连解毒汤调节模型小鼠血脂代谢的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂

黄连（批号：2019120581）、黄芩（批号：191201）、黄柏（批号：2000101）、栀子（批号：191223）均购于江苏同济中药饮片有限公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定均符合2020 年版《中国药典》规定；小檗碱（含量：98%，批号：KJ20200718）、黄芩苷（含量：95%，批号：KJ20200804）、栀子苷（含量：95%，批号：KJ20200904）均购于武汉凯杰药业有限责任公司；辛伐他汀（含量：97%，批号：026M4002V，Sigma-Aldrich）；甘油三酯（TG）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（LCAT）试剂盒，均购于南京建成生物工程公司；小鼠低密度脂蛋白（LDL）ELISA试剂盒（上海笃玛生物科技有限公司）；脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）试剂盒（Cayman Chemical）。

1.2 仪器

BS224 型 电 子 天 平（德 国Sartorius）；Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；TGL-16C 型离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；YXQ-LS-50S Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业医疗设备厂）；Direct-Q with pump型超纯水仪（德国Merck Millipore 公司）；LB941 型微孔板式多功能酶标仪（德国Berthold 公司）；YC-300L 型药品储存柜（中科美菱低温科技有限责任公司）；FORMA700型超低温冰箱（美国Thermo 公司）；ZORBAXSB-C18色谱柱（美国安捷伦科技公司，4.6 mm × 250 mm，5 μm）。

1.3 动物与饲料

SPF 级C57BL/6J 小鼠，6 周龄，雄性，体质量为（21±2）g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（苏）2015-0001。标准饲料（PicoLab Rodent Diet 20，5053，14% from fat）；高脂饲料（Harlan Teklad TD.88137，42% from fat）。

2 方法

2.1 高血脂模型小鼠制备

C57BL/6J 小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组、黄连解毒汤组、黄连解毒汤模拟药物组、小檗碱高剂量模拟药物组、黄芩苷高剂量模拟药物组和缺栀子苷模拟药物组，每组8 只，共8 组。正常组给予标准饲料，其它组给予高脂饲料，室内温度为（23 ±2）℃，自由饮食和摄水。造模12 周后取血测总胆固醇（12 周期间各组给予相对应饲料和水，未给药）。

2.2 药物制备

黄连、黄芩、黄柏、栀子按质量3 ∶2 ∶2 ∶3分别称取黄连45 g、黄芩30 g、黄柏30 g、栀子45 g，加10 倍量水煎煮1.5 h，收集滤液；再加8 倍量水煎煮1.5 h，收集滤液；合并两次滤液，浓缩至1 g 生药/mL。并采用HPLC 测定复方中小檗碱、黄芩苷、栀子苷的含量。色谱条件：流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL，检测波长：238、280、345 nm[9]。

模拟药物配制：按复方中小檗碱、黄芩苷、栀子苷的成分含量和比例进行模拟，根据前期实验对黄连解毒汤HPLC 含量测定的结果（小檗碱：14.85 mg/mL、黄芩苷：10.59 mg/mL、栀子苷：13.46 mg/mL），分别称取适量小檗碱、黄芩苷、栀子苷配制模拟药物，得到黄连解毒汤原方模拟药物（小檗碱：14.85 mg/mL、黄芩苷：10.59 mg/mL、栀子苷：13.46 mg/mL）、黄连解毒汤小檗碱高剂量模拟药物 （小檗碱：29.70 mg/mL、黄芩苷：10.59 mg/mL、栀子苷：13.46 mg/mL）、黄连解毒汤黄芩苷高剂量模拟药物（小檗碱：14.85 mg/mL、黄芩苷：21.18 mg/mL、栀子苷：13.46 mg/mL）、黄连解毒汤缺栀子苷模拟药物（小檗碱：14.85 mg/mL、黄芩苷：10.59 mg/mL）。

2.3 给药与血样采集

正常组和模型组灌胃相同体积生理盐水，阳性药物组灌胃辛伐他汀（0.007 g/kg），其它组参考《中药药理研究方法学》[10]实验动物剂量换算，分别灌胃相应中药或模拟药物，给药剂量为6.53 g/kg。连续给药四周后眼眶采血，血液于离心机2 000 r/min 离心20 min，收集血清待用。采用GPO-PAP 酶法试剂盒测总胆固醇、甘油三酯，采用SOD 试剂盒（WST-1 法）测SOD，采 用ELISA 试 剂 盒 测LDL、Lp-PLA2、LCAT 等指标。

2.4 统计学方法

用Graphpad Prism 8.0 统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组血脂指标比较

造模12 周后取血测总胆固醇，与正常组相比，模型组和给药组小鼠胆固醇明显升高（P＜ 0.05），提示高血脂症小鼠造模成功。给药后，与模型组相比，阳性药物组、黄连解毒汤组、黄连解毒汤模拟药物组和小檗碱高剂量模拟药物组TC、TG 和LDL 水平均明显下降（P＜ 0.05），其中，小檗碱高剂量模拟药物组与阳性药物组作用基本相当。与阳性药物组相比，黄芩苷高剂量模拟药物组和缺栀子苷模拟药物组各项指标明显上升（P＜ 0.05），见表1。

表1 各组给药后血脂指标比较 （±s, n = 8）Tab. 1 Comparison of blood lipid indexes after administration in each group （±s, n = 8）

表1 各组给药后血脂指标比较 （±s, n = 8）Tab. 1 Comparison of blood lipid indexes after administration in each group （±s, n = 8）

注：模型组与正常组比较，*P ＜0.05；各给药组与模型组比较， #P ＜0.05；黄连解毒汤及其模拟组与阳性药物组比较，△P ＜0.05。

组别 TC /（mmol/L） TG /（mmol/L） LDL-C /（mmol/L）正常组 2.04 ± 0.20 0.83 ± 0.15 3.18 ± 0.54模型组 4.32 ± 0.73* 1.90 ± 0.15* 7.67 ± 1.45*阳性药物组 2.07 ± 0.25# 0.86 ± 0.07# 3.23 ± 0.44#黄连解毒汤组 3.16 ± 0.18# 1.34 ± 0.17# 5.57 ± 0.71#△黄连解毒汤模拟药物组 2.74 ± 0.22# 1.17 ± 0.16# 4.74 ± 0.50#小檗碱高剂量模拟药物组 2.29 ± 0.08# 0.95 ± 0.13# 3.91 ± 0.73#黄芩苷高剂量模拟药物组 3.68 ± 0.71△ 1.78 ± 0.22△ 6.58 ± 0.57△缺栀子苷模拟药物组 3.42 ± 0.26△ 1.69 ± 0.23△ 6.37 ± 0.85△F 16.753 25.882 17.945 P 0.000 0.000 0.000

3.2 各组模拟药物对Lp-PLA2 的影响

与正常组相比，模型组Lp-PLA2 升高（P＜0.05），达到（190.05±17.68）nmol/mL。与模型组相比，各给药组Lp-PLA2 均有不同程度下降，其中，阳性药物组和小檗碱高剂量模拟药物组明显降低（P＜ 0.05），分别为（124.08±10.66）nmol/mL、（137.17±10.13）nmol/mL。与阳性药物组相比，黄芩苷高剂量模拟药物组和缺栀子苷模拟药物组则明显升高（P＜ 0.05），分别为（171.46±11.16）nmol/mL和（161.04±12.37）nmol/mL，见图1。

图1 各组药物对Lp-PLA2 的影响（n = 8）Fig. 1 The effect of different drugs on Lp-PLA2（n = 8）

3.3 各组模拟药物对SOD 的影响

与正常组相比，模型组SOD 表达明显下降（P＜0.05），为（11.28±1.16）U/mL。与模型组相比，各给药组SOD 表达均有上升，其中，阳性药物组、黄连解毒汤组、黄连解毒汤模拟药物组和小檗碱高剂量模拟药物组表达均明显升高（P＜ 0.05），分别为（18.87±0.91）U/mL、（15.06±1.41）U/mL、（16.26±0.98）U/mL 和（17.03±1.36）U/mL。与阳性药物组相比，黄芩苷高剂量模拟药物组和缺栀子苷模拟药物组SOD 表达明显降低（P＜ 0.05），分别为（12.49±1.20）U/mL、（14.04±1.02）U/mL，见图2。

图2 各组药物对SOD 的影响（n = 8）Fig. 2 The effect of different drugs on SOD（n = 8）

3.4 各组模拟药物对LCAT 的影响

与正常组相比，模型组LCAT 表达明显下降（P＜0.05），为（14.93±1.88）ng/mL。与模型组相比，各给药组LCAT 表达均有上升，其中，阳性药物组、黄连解毒汤组、黄连解毒汤模拟药物组和小檗碱高剂量模拟药物组表达均明显升高（P＜ 0.05），分别为（34.41±3.24）ng/mL、（22.85±3.46）ng/mL、（27.98±2.52）ng/mL 和（33.46±2.35）ng/mL。与阳性药物组相比，黄芩苷高剂量模拟药物组和缺栀子苷模拟药物组LCAT 表达明显下降（P＜ 0.05），分别为（20.66±4.60）ng/mL、（17.21±3.77）ng/mL，见图3。

图3 各组药物对LCAT 的影响（n = 8）Fig. 3 The effect of different drugs on LCAT（n = 8）

4 讨论

黄连解毒汤及其模拟药物对胆固醇作用效果基本相近，为模拟组合筛选进一步研究提供了相关基础。小檗碱能通过抑制炎症因子、延缓血管内皮损伤、促进脂质逆转运与清除等方式促进脂代谢平衡。增加复方黄连解毒汤模拟药物中小檗碱的含量有利于降低TC、TG、LDL 等指标，同时能明显抑制Lp-PLA2 等炎症因子的表达；而高剂量的黄芩苷则使复方抗炎作用明显弱化，且不利于发挥复方整体的降脂作用，此结果可能与黄芩苷与小檗碱形成共沉淀而影响小檗碱吸收有关；相关研究也表明二者可以通过配比优化分别作用于不同靶点，从而在复方中对炎症反应发挥互补作用[11]，两者间针对降脂作用的最佳比例有待后续研究。通过本实验研究结果可以推测，以小檗碱为代表的生物碱类是黄连解毒汤调节血脂代谢的关键组分。

黄连解毒汤中黄芩苷等黄酮类组分、黄连提取物和栀子提取物均有抗氧化活性，但与栀子黄色素相比，栀子苷的抗氧化作用稍弱[12-13]。本研究结果表明，不同比例的模拟组合药物都能提高高血脂小鼠的SOD 活性，增强抗氧化能力；但黄芩苷高剂量组SOD 表达明显弱于黄连解毒汤模拟药物组和小檗碱高剂量组，也从侧面表明高剂量的黄芩苷有可能削弱复方中以小檗碱为代表的生物碱类成分的抗氧化作用，而降低复方中黄酮类成分对抗氧化能力的影响还有待于进一步研究。

LCAT 是胆固醇逆转运（RCT）过程中催化胆固醇生成胆固醇酯的关键酶，是血脂代谢的重要环节。在黄连解毒汤模拟药物中小檗碱比例的增加能明显提高LCAT 的表达，从而有利于外周胆固醇通过RCT 途径加速代谢，而缺栀子苷模拟药物组和黄芩苷高剂量模拟药物组的LCAT 表达明显低于其它给药组，此结果也表明小檗碱和栀子苷在复方降脂过程中具有协同作用。

小檗碱+黄芩苷+栀子苷和黄连解毒汤全方在大鼠各个肠段的有效渗透系数、吸收速率参数均明显优于小檗碱单体[14]。小檗碱、小檗碱+黄芩苷、小檗碱+栀子苷以及小檗碱+黄芩苷+栀子苷的药动学研究也表明，栀子苷对小檗碱吸收有明显促进作用，而黄芩苷则相反，但三者组合则又能降低黄芩苷对小檗碱吸收的影响[15]。由于栀子苷的吸收和分布均较快，血药浓度达峰时间为三者中最快，且消除相对缓慢[16]，也为栀子苷促进复方中其它成分的吸收和代谢提供了可能。综上所述，并结合本实验结果可推断，在复方中促进小檗碱的吸收和代谢，以及弱化黄芩苷对复方整体的影响是栀子苷发挥降脂作用的一个重要方面，而栀子苷与其它成分的优化配比也有待深入研究。

5 结论

通过黄连解毒汤组合模拟体系的研究，从简化的角度认识了以小檗碱为代表的生物碱类成分在复方黄连解毒汤中的主导作用，同时为其它中药复方的作用机制研究提供了更多的探索方法，也有利于临床根据患者的治疗侧重点通过加减方充分发挥中药复方辨证论治、用药配伍与综合调理的作用。黄连解毒汤中各组分的配比优化有利于实现复方作用的最大化。模拟组合药物中各成分的比例需要在后续研究中更加细化，逐步探索多种组分的最优组合，而含量变化对肝肾等功能的影响也需要进一步考察。