状态性焦虑对小鼠睡眠-觉醒周期的影响

杨 悦，卞宏生，王艳艳，于 爽，李廷利，黄莉莉

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

状态性焦虑是指某一特定情境引起的短暂情绪状态，与交感神经系统活动暂时增强有关[1]。而睡眠与情绪大脑之间存在密切关系，睡眠-觉醒行为通过不同脑区各类核团的相互制约来调控[2]。临床研究表明，患有焦虑症的人出现睡眠障碍症状的风险更高[3]，同时睡眠不足将导致状态性焦虑水平增加[4]。Ramos等[5]提出的Triple test装置是将经典的旷场(open field，OF)、高架十字迷宫(elevated plus maze，EPM)和明暗穿梭箱(light/dark box，LDB)物理整合，不仅用于状态性焦虑模型的复制和评价，还可用于药物筛选和检测与焦虑相关的遗传差异[6]。且经本实验室前期研究发现，其复制的状态性焦虑模型小鼠存在明显的探究行为抑制与HPA轴亢进[7]，但该模型下小鼠睡眠-觉醒周期的变化尚不明确。为进一步了解状态性焦虑与睡眠-觉醒行为之间的关系，在Triple test装置复制小鼠状态性焦虑模型基础上，利用皮层脑电记录与分析技术观察状态性焦虑对小鼠睡眠-觉醒周期的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性ICR小鼠18只，SPF级，体质量(25～30)g，购自黑龙江中医药大学药物安全评价中心。许可证号：SCXK(黑)2013-004。

1.2 实验条件小鼠饲养于独立通气笼(IVC)中，恒定光照条件(早7 ∶00照明，晚19 ∶00熄灯)，光照强度：300 lux。室温：(23±1) ℃，相对湿度：(55±5)%。按体质量分笼饲养(6只/笼)并自由摄取食水。

行为测试环境：相对湿度：(55±5)%；环境温度：(22±2) ℃；环境噪音≤ 40 dB；实验期间，所有光照均来自Triple Test实验装置的光源，光照强度：LDB明箱：750 lux，LDB暗箱：20 lux，EPM：15 lux，OF：10 lux

屏蔽室监测环境：恒温(24±1) ℃、恒湿(55±10)%、恒定光照条件(早7 ∶00照明，晚19 ∶00熄灯)的屏蔽室中进行，监测环境通气、隔音。

1.3 主要仪器设备RU25H5型独立通气笼IVC(苏杭科技器材有限公司)；51600型小鼠脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；MP150型十六导生理信号记录仪(美国BIOPAC公司)；三重复合装置(自制；Triple test)。

1.4 状态性焦虑小鼠模型复制与行为学评价

1.4.1状态性焦虑小鼠模型复制 Triple test实验装置[6]由OF、EPM、LDB整合而成(Fig 1)，OF由白色木板构成包括55 cm(L)×55 cm(W)的底板(等分为25个方格，中央区9格，周边区16格)和30 cm(H)的围墙。EPM由黑色木板构成，包括5 cm(L)×30 cm(W)×15 cm(H)的相对闭臂和5 cm(L)×30 cm(W)的相对开臂，开臂有0.5 cm防掉落的边缘突起，EPM闭臂两侧分别通过5 cm×5 cm的开口连通OF和LDB。LDB由白板和黑板构成，包括27 cm(L)×27 cm(W)×27 cm(H)的明箱和27 cm(L)×18 cm(W)×27 cm(H)的暗箱，分隔明暗两侧的是27 cm(W)×30 cm(H)的隔板，隔板底部中央有5 cm×5 cm的开口可连通。整个装置提升至距离地面0.5 m。

Fig 1 Triple test

制备方法：模型于每日13 ∶00-18 ∶00进行。将实验动物提前30 min分单笼置于Triple Test装置所在环境中适应。实验开始时，提取鼠尾，将实验动物置于OF正中央格背朝OF开口一侧释放同时开始计时，每只动物自由探索装置15 min。实验结束后取出实验动物，放回原笼，运回饲养室，并用10%酒精清洁箱体，去除异味及动物排泄物。

1.4.2行为学评价指标及判断标准 通过录像采集或计算每只小鼠在Triple test装置中15 min的如下行为参数：

OF：中央格运动时间(OF inner time)：

四肢全部进入到中央9格区的总时间

中央格运动时间%(OF inner time %)：

EPM：开臂停留时间(EPM open time)：

四肢全部进入开臂的总时间

开臂停留时间%(EPM open time %)：

开臂进入次数(EPM open entries)：

四肢全部进入开臂的频次之和

开臂进入次数%(EPM open entries%)：

LDB：明箱停留时间(LDB time in light)：

四肢全部进入明区的总时间

暗箱停留时间(LDB time in black)：

四肢全部进入暗区的总时间

明箱停留时间%(LDB time in light %)：

穿梭运动次数(LDB transitions)：

四肢全部从一区跨入另一区频次之和

1.5 小鼠的脑电记录与分析

1.5.1小鼠皮层脑电电极与肌电电极埋置 实验动物先用水合氯醛经腹腔注射麻醉后，将其固定于脑立体定位仪上。用碘酒棉将小鼠头顶浸润消毒。电极埋置：无菌暴露颅骨，酸蚀剂去除组织筋膜，盐水清洁颅骨表面后于前囟前1 mm，额骨中线旁开1.5 mm；人字缝前1 mm，顶骨中线旁开1.5 mm处分别插入2根脑电电极，使接触硬脑膜，并用牙托粉进行固定。术后将小鼠置于有机玻璃笼内单笼饲养恢复1周，自由摄取食水，并连续3 d经腹腔注射青霉素。

1.5.2小鼠脑电图(electroencephalogram，EEG)和肌电图(electromyogram，EMG)分析判断标准 恢复期后小鼠置于屏蔽室，将头部插座与十六导生理记录仪相连，调试设备，描记EEG和EMG信号，Sleep Sign 3.0软件分析(10s/帧)，监测指标的记录和判断如下：

(1)觉醒时间(Wake)和觉醒所占比例(Wake%)：EEG信号呈现不规则的低幅度高频波动；EMG呈现高幅波动(Fig 2)。

Fig 2 Awakening

(2)非快动眼睡眠时间(NREMS)和非快动眼睡眠时相所占比例(NREMS%)：EEG呈现高振幅慢波和特征性的纺锤波；EMG明显减弱(Fig 3)。

Fig 3 Non-rapid eye movement sleep

(3)快动眼睡眠时间(REMS)和快动眼睡眠时相所占比例(REMS%)：EEG呈现低幅高频θ波；EMG基本消失(Fig 4)。

Fig 4 Rapid eye movement sleep

1.6 状态性焦虑小鼠睡眠-觉醒周期的变化实验动物经皮层脑电埋置术后恢复，按上述测试条件，将小鼠移至脑电描记室，连接电极插座，连续描记24 h的EEG和EMG信号，以作为模型复制前脑电图的基线对照。脑电图描记后次日的13：00进行小鼠状态性焦虑造模(d 1)，每只鼠测试15 min，测试完成后再次连接十六导生理记录仪，连续描记24 h的脑电图。每日1次，连续7 d。

2 结果

2.1 状态性焦虑小鼠的行为学评价

2.1.1状态性焦虑小鼠OF中的行为学变化 结果见Fig 5。OF中行为学评价结果表明，与造模d 1相比，状态性焦虑小鼠OF中央运动时间d 4、5、7明显减少(P<0.05；P<0.01)，OF中央运动时间% d 3-5明显降低(P<0.05；P<0.01)，呈现OF中探究行为的抑制。

Fig 5 Time and its % time spent in central area of OF

2.1.2状态性焦虑小鼠EPM中的行为学变化 结果见Fig 6。EPM中行为学评价结果表明，与造模d 1相比，状态性焦虑小鼠开臂进入时间及时间%、开臂进入次数及次数%均呈逐日上升趋势，d 4开始均具显著变化(P<0.01)。

Fig 6 Time and its % time spent in open arms of EPM, number of open arm entries and its % entries n=18)

2.1.3状态性焦虑小鼠LDB中的行为学变化 结果见Fig 7。LDB中行为学评价结果表明，与造模d 1相比，状态性焦虑小鼠明箱运动时间及时间%、穿梭运动次数在d 5～7均明显增加(P<0.05，P<0.01)。暗箱运动时间于d 2(P<0.01)、d 4(P<0.05)明显增加。

Fig 7 Time spent and frequency of transitions of LDB n=18)

2.2 状态性焦虑小鼠睡眠-觉醒周期的变化

2.2.1状态性焦虑小鼠睡眠-觉醒时间的变化 结果见Fig 8。脑电图分析结果表明，与基线睡眠相比，状态性焦虑小鼠Wake时间明显延长，同时NREM睡眠时间明显缩短(P<0.05，P<0.01)，REM睡眠时间偶见明显延长(P<0.05)。且相比于夜间，日间觉醒-睡眠时间的改变更加明显。

Fig 8 Changes in awakening-sleep time in mice with state n=18)

2.2.2状态性焦虑小鼠觉醒-睡眠时相的变化 结果见Fig 9。脑电图分析结果表明，与基线睡眠相比，状态性焦虑小鼠Wake时间比例明显增加，同时NREMS时间比例明显下降(P<0.05,P<0.01)，REMS时间比例偶见明显升高(P<0.05)。且相比于夜间，日间觉醒-睡眠时相的改变更加明显。

Fig 9 Changes in awakening-sleep phase in mice with state anxiety n=18)

3 讨论

焦虑症和睡眠障碍之间往往存在着紧密联系，失眠是广泛性焦虑症的一个症状标准，且睡眠不足可能赋予患焦虑症及相关疾病的风险[8-9]。课题组前期研究发现，Triple test装置复制的状态性焦虑小鼠呈现明显的焦虑样行为伴有HPA轴失调，但未对状态性焦虑小鼠的睡眠活动进行监测。因此，本实验应用Triple test装置复制小鼠状态性焦虑模型，同时进行脑电图描记，探讨状态性焦虑对睡眠-觉醒周期的影响。

焦虑动物模型的复制方法诸多，在非条件化动物模型中OF、EPM和LDB最为常见，当前的观点认为围绕OF、EPM、LDB间焦虑指标的相互关系很少，行为变量的主成分分析体现在不同的因素上，表明不同测试反映了情感的不同维度，那么应用单独的测试来评估情绪是不够全面的，而一系列不同的测试又存在先前测试经验对后续测试的影响[10]。Triple test作为经典的焦虑测试装置的集成，实现了同时进行情绪的多维度考察，最大程度减轻了相继测试所致的混淆影响，还可与运动活性的变化区分开，被证明是一种焦虑和一般活动性的可靠测量方式[6-7]。本研究发现，状态性焦虑小鼠呈现明显的探究性行为抑制，表明Triple test可复制和评价小鼠的状态性焦虑模型，且前4 d表现更多的焦虑样行为。

脑电图是客观反映睡眠架构的重要指标，是国际公认的评价参数[11]，可用于睡眠-觉醒周期的分析。焦虑对睡眠的影响多体现在睡眠时长、睡眠连续性、睡眠深度和REM睡眠压力的改变[8]。相关报道指出，高焦虑个体往往存在睡眠深度的抑制，而NREM睡眠对于抵抗焦虑症的发展至关重要[12-13]。研究在模型复制基础上探讨了焦虑与睡眠之间的关系，得知状态性焦虑小鼠伴有觉醒-睡眠时间和睡眠时相的改变，表现为约束小鼠的睡眠时长和睡眠深度及REM睡眠压力的偶见升高，且指标上看对日间睡眠的影响更加明显。

另外，经查阅文献得知基底外侧杏仁核(BLA)和中央杏仁核(CeA)在焦虑过程中起着特别重要的作用。BLA与内侧前额叶皮层(mPFC)的交互连接与焦虑密切相关[14]，BLA接收来自丘脑和前额叶皮质的感觉信息传入，激活CeA后向脑内不同靶区进行投射，从而呈现不同的焦虑样反应[15]。目前认为杏仁核可以驱动觉醒中枢兴奋，而在睡眠-觉醒状态的调节过程中食欲素(orexin，包括orexin-A和orexin-B)发挥重要作用，它是由下丘脑外侧区orexins神经元释放的神经递质，可作用于上行网状激活系统，使睡眠缩短而觉醒程度增加[16]。研究发现，脑室内灌注orexin-A可引起焦虑样行为，表现为OF的中央运动时间和EPM开臂时间减少[17]。而orexin缺乏会减弱谷氨酸能激活下丘脑外侧区产生的唤醒行为[18]。因此，推测焦虑引起的睡眠-觉醒周期的改变可能与杏仁核驱动的下丘脑外侧区释放orexin增加有关。为今后探讨相关机制丰富理论基础，且作为初步研究与状态性焦虑和睡眠-觉醒周期相关的药效学研究有待进一步开展。