不同硒源和浓度对饲用苎麻幼苗生理生化特性的影响

朱娟娟，喻春明，陈继康，陈 平，熊和平

（1.北方民族大学，生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021；2.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

苎麻（Boehmeria niveaL.）是荨麻科苎麻属的多年生植物，主要用作纺织原料，是我国特有的主要纤维作物之一[1]，但其纤维部分仅占整株植物的15%，剩下85%的副产物很少被利用，从而造成资源的巨大浪费。为了使苎麻得到充分的利用，前人对其饲用营养成分进行全面分析后，指出苎麻叶片含有较高的粗蛋白[2-3]和非常适宜的氨基酸[4]。李宗道等[5]研究表明，苎麻叶营养丰富，其粗蛋白含量是稻谷的2倍、玉米的3倍；含钙量为玉米的200倍；还含有8种人、畜需要的氨基酸，其中赖氨酸1.35%、苏氨酸1.12%、异亮氨酸1.15%、苯丙氨酸1.39%、谷氨酸2.83%、蛋氨酸1.37%，类胡萝卜素和核黄素含量非常丰富，且叶片中纤维量含量相对较少。此外，我国南方夏季湿热天气并不适宜苜蓿的生长发育，而苎麻生长发育良好，生物量高。曾日秋等[6]报道鲜饲苎麻产量能够达到3.19×105kg·hm-2，朱涛涛[7]发现当苎麻高度达到65 cm时进行刈割，其生物产量约为9×104kg·hm-2。因此，基于牲畜饲料成本的上升和提高高蛋白饲料生产的需求，特别是在传统饲料作物不能很好地用于畜牧业发展的地区，苎麻成为替代传统饲料作物的优选作物，不仅营养丰富，而且适合所有农场动物食用，对牛[8]、羊[9]、猪[10]、马和家禽[11]的饲喂研究，均表明苎麻是一种良好的绿色饲料营养资源[12]。

硒是动物必需的微量元素，具有抗氧化、增强免疫、抗炎、化学防御、抗病毒、抗癌、解毒重金属等多种生物功能[13-14]，被认为是动物体抗氧化系统的主要参与者[15]。饲草中硒元素能够维持种畜肥力和家禽精液质量[16]，提高新生仔猪血清抗氧化能力，提高肝脏总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽的含量，并降低血清丙二醛含量[17]，故饲草中含有充足的硒元素，对畜禽的生长发育至关重要。饲料植物能够将无机硒（亚硒酸盐或硒酸盐）转化为有机硒。虽然硒在地壳中的丰度较低（＜0.05 mg·kg-1）[18]，但通过土壤施用或叶面喷施硒肥可以显著提高植物组织硒浓度[19]；同时，外源硒对植物生长具有积极作用[20]，能够增加植物叶片叶绿素和类胡萝卜素含量[21]，提高植物耐受性潜力[22]，饲料作物中硒的生物强化是防治畜禽硒缺乏症的良好策略之一，同时也解决了与其经济可行性和社会可接受性相关的潜在问题。前人大量研究了外源硒对水稻[23]、小麦[24]、玉米[25]、果树[26]、苜蓿[27]、燕麦[28]等作物生理生化特性的影响，但对饲用苎麻生理生化特性的报道甚少。目前随着对苎麻饲用化研究的深入，揭示苎麻生理生化特性对外源硒的响应具有重要意义。因此，本文以饲用苎麻“中饲苎1号”为试验材料，通过盆栽试验，研究不同硒源和浓度下苎麻生物量、光合色素含量、超氧阴离子含量和产生速率、抗氧化酶活性、丙二醛含量以及可溶性蛋白含量的变化，揭示不同价态硒和浓度对苎麻生理生化特性的调控机理，旨在为提高苎麻饲用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苎麻品种为“中饲苎1号”，由中国农业科学院麻类研究所提供。

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计，硒肥为硒酸钠（Se6+）和亚硒酸钠（Se4+），参照其他研究中硒浓度的设置[29]，并考虑到苎麻对重金属元素的耐受性[30]，共设计4个硒肥量，分别为硒 0、0.9、1.8、2.7 mg·kg-1干土，每处理重复3次，每个重复6株幼苗。供试土壤为中国农业科学院麻类研究所长沙望城试验基地0～30 cm的红壤土。试验前土壤自然风干，过筛去杂后根据施硒量，将硒肥溶解于蒸馏水中均匀喷洒于土壤中并混匀，待平衡一周后装盆，每盆（直径36 cm，高28 cm）盛干土20 kg，施入7.5 g复合肥，随后移栽苎麻扦插苗，处理30 d后收苗，一份迅速放入液氮罐中带回，保存于-80℃冰箱用于生理生化指标的测定；另一份带至实验室烘箱高温杀青（105℃，30 min），在70℃下烘干至恒重，测定苎麻各器官生物量和含硒量。

1.3 测定指标与方法

苎麻植株生物量采用称重法测定；超氧阴离子产生速率采用羟胺氧化法测定，其标准曲线为y=0.1149x-0.002，R2=0.9961（x表示NaNO2浓度，y表示OD值）；叶绿素和类胡萝卜素含量采用分光光度法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化学还原法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用过氧化氢紫外分光光度法测定；谷胱甘肽-S-转移酶（GSH-ST）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活性均采用南京建成生物有限公司酶联试剂盒测定。硒含量采用氢化物发生－原子荧光光谱法（GB 5009.93-2010）测定。

1.4 数据分析

本试验采用SAS 12.1进行方差分析，结果以平均值±标准误表示，不同处理间差异比较采用最小显著差别（LSD）法进行多重比较，利用Excel 2013和Sigma Plot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同硒源和浓度对苎麻植株各器官硒含量和生物量的影响

由表1可知，土壤施硒能够显著（P＜0.05）提高苎麻硒含量和硒积累总量，随着施硒量的增加苎麻叶片和茎秆中硒含量及硒积累总量也随之增加，但不同浓度Se4+处理间茎秆硒含量和硒积累总量无显著性差异（P＞0.05），而Se6+处理中苎麻叶片和茎秆中硒含量及硒积累总量极显著（P＜0.001）高于对照。0.9 mg·kg-1施硒量下，Se6+处理中苎麻叶片和茎秆硒含量及硒积累总量极显著（P＜0.001）高于Se4+处理，而1.8和2.7 mg·kg-1Se6+处理中因苎麻植株全部死亡，无法获得相关数据，则表明相同浓度下硒酸钠（Se6+）比亚硒酸钠（Se4+）的生物有效性强，更易造成植株伤害。同时，Se4+处理中苎麻叶片和茎秆生物量与对照均无显著性差异（P＞0.05），但2.7 mg·kg-1Se4+处理中地上部分总生物量显著低于对照。0.9 mg·kg-1Se6+处理中苎麻各器官生物量显著低于CK和相同浓度Se4+处理，说明0.9 mg·kg-1Se6+对植株已经造成伤害。

表1 不同硒源和浓度对苎麻各器官硒含量、生物量和硒积累总量的影响

2.2 不同硒源和浓度对苎麻叶片光合色素的影响

由图1可知，0.9 mg·kg-1Se6+处理中苎麻叶片光合色素的合成受到抑制，整个生育期显著低于其他处理。不同Se4+处理在前期对苎麻叶片光合色素无显著影响，而处理30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+处理中苎麻叶片叶绿素a（图1a）、叶绿素b（图1b）和总叶绿素含量（图1c）显著高于对照，但不同Se4+处理间无显著性差异。与对照相比，苎麻叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素（图1d）含量在0.9 mg·kg-1Se4+处理中分别增加21.8%、64.4%、28.5%和18.9%，在1.8 mg·kg-1Se4+处理中分别增加13.6%、47.0%、18.9%和17.0%，在2.7 mg·kg-1Se4+处理中分别增加16.4%、31.7%、18.9%和15.0%，但在0.9 mg·kg-1Se6+处理中分别降低33.5%、36.7%、34.0%和24.0%。

由图1e可知，施用硒后，苎麻叶片叶绿素a与叶绿素b的比值（Chl a/b）均有所升高，且0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处理显著高于对照，而随着苎麻生育期的推进，硒处理与对照间无显著性差异。当施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+处理的Chl a/b值显著低于对照，而其他处理与对照间无显著性差异。由图1 f可知，整个生育期亚硒酸钠处理中叶绿素与类胡萝卜素的比值（Chl/Car）与对照间无显著性差异，而0.9 mg·kg-1Se6+处理中Chl/Car值显著低于其他处理。

图1 不同硒源和浓度对苎麻叶片光合色素及其相互比值的影响

2.3 不同硒源和浓度对苎麻叶片中超氧阴离子含量和产生速率的影响

由图2可知，随着生育时期的推进，对照和亚硒酸钠（Se4+）处理中苎麻叶片超氧阴离子含量变化幅度非常小，保持在60～100 nmol·g-1之间；而0.9 mg·kg-1Se6+处理中苎麻叶片超氧阴离子含量极显著（P＜0.001）高于其他处理，达到300 nmol·g-1以上，但在生育末期其含量降低了78.7%，与其他处理间无显著性差异。同时，苎麻植株叶片中超氧阴离子产生速率与其含量变化基本相同。由此可见，0.9 mg·kg-1Se6+处理导致细胞内生物自由基代谢平衡被破坏，造成超氧阴离子自由基的大量积累，对植株造成伤害，故苎麻植株生物量显著下降。

图2 不同硒浓度和价态硒元素对苎麻叶片中超氧阴离子含量及其产生速率的影响

2.4 不同硒源和浓度对苎麻叶片抗氧化酶活性的影响

由图3a～c可知，整个生育期苎麻叶片SOD活性保持在800～1000 U·g-1之间，但各处理间均无显著性差异。POD活性保持在500～3600 U·g-1·min-1之间，其中0.9 mg·kg-1Se6+处理显著高于其他处理，达到1700～3600 U·g-1·min-1，表明植株叶片中H2O2含量较高，为了缓解H2O2的伤害，导致POD含量增加从而催化H2O2歧化成无毒害的H2O和O2。CAT活性保持在3.0～22.5 U·g-1·min-1之间，但不同处理时间的硒对其影响有所不同。施硒30 d后，硒处理中叶片CAT活性均显著高于对照，而不同硒处理间相比较，2.7 mg·kg-1Se4+处理中活性最高，1.8 mg·kg-1Se4+处理中活性最低。

由图3d可知，随着生育期的推进，苎麻叶片GSH-ST活性逐渐降低。施硒10 d后，0.9 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处 理 中GSH-ST活性显著低于对照；施硒20 d后，亚硒酸钠各浓度处理中GSH-ST活性显著低于对照；但到施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se6+处理中GSH-ST活性显著高于对照，是其的3倍，而亚硒酸钠各浓度处理与对照间均无显著性差异。

图3 不同硒源和浓度对苎麻植株叶片抗氧化酶活性的影响

由图3e可知，整个生育期，0.9 mg·kg-1Se6+处理中GSH-PX活性显著高于其他处理，施硒30 d后，分别比CK、0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+和2.7 mg·kg-1Se4+提高51.0%、46.2%、42.0%和85.7%。

由图3f可知，随着生育期的推进，苎麻叶片GR活性逐渐增加，整个生育期，硒元素能够提高苎麻叶片GR活性。施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处理中GR活性显著高于其他处理。与对照相比，0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处 理中GR活性分别提高37.6%、132.5%、21.5%和224.7%。

2.5 不同硒源和浓度对苎麻叶片膜质过氧化作用的影响

丙二醛（MDA）是膜质过氧化的最终分解产物，是植物细胞膜质过氧化程度的体现，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。由图4可知，施用硒处理10 d后，不同处理间MDA含量无显著性变化；处理20 d后，0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处理中叶片MDA含量均显著低于对照；处理30 d后，硒处理中叶片MDA含量均低于对照，且0.9 mg·kg-1Se6+处理与CK间存在显著性差异。与对照相比，0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+处理叶片MDA含量分别降低16.5%、10.4%、2.7%和34.6%。

图4 不同硒源和浓度对苎麻叶片丙二醛（MDA）含量的影响

2.6 不同硒源和浓度对苎麻叶片可溶性蛋白的影响

由图5可知，施用硒处理10 d后，仅0.9 mg·kg-1Se6+处理中叶片可溶性蛋白含量显著高于对照，而其他处理间无显著性差异。随后硒处理与对照间均无显著性差异，但当处理30 d后，0.9 mg·kg-1和1.8 mg·kg-1Se4+处理中叶片可溶性蛋白含量显著高于对照，而0.9 mg·kg-1Se6+处理中可溶性蛋白含量显著低于对照，但2.7 mg·kg-1Se4+处理与对照间无显著性差异。说明硒元素能够一定程度的提高苎麻叶片可溶性蛋白含量和细胞的保水能力，但相同施用量的条件下，Se4+的效果优于Se6+。

图5 不同硒源和浓度对苎麻植株叶片可溶性蛋白含量的影响

3 讨论

植物中硒元素主要来自土壤，而土壤中硒元素按价态可划分为Se2-、Se0、Se4+和Se6+4种形态，但Se0和Se2-与有机物结合都不溶于水，很难直接被植物吸收利用，则Se4+和Se6+是作物吸收硒元素的主要形式，其中Se4+主要以亚硒酸盐形式存在，Se6+主要以硒酸盐形式存在[31]。然而，植物对亚硒酸盐和硒酸盐的吸收和转运存在着相当大的差异，亚硒酸盐主要以被动运输方式通过磷酸或硅酸转运蛋白作用进入植物体内，随后在根系中合成有机硒，再运输至地上组织，其主要积累的部位是根部；而硒酸钠主要以主动运输方式通过硫酸转运蛋白作用进入植物体内，随后迅速运输至地上组织，再在叶片中合成有机硒，其主要积累的部位是叶片[32]，故解释了本研究中0.9 mg·kg-1Se6+处理苎麻地上部硒含量和硒积累总量远远高于0.9 mg·kg-1Se4+处理，且不同浓度Se4+处理间苎麻硒含量和硒积累总量无显著性差异。Kahakachchi等[33]研究表明，亚硒酸钠处理的芥菜茎叶组织中亚硒酸盐占4.3%，有机硒占86.6%，硒酸盐没有被检测到；而硒酸盐处理的芥菜茎叶组织中硒酸盐占82.8%，有机硒占15.3%，说明亚硒酸盐在植物中容易还原为有机化合物，而硒酸盐更易造成植物伤害，这解释了本研究中1.8 mg·kg-1和2.7 mg·kg-1Se6+处理中苎麻植株全部死亡，而0.9 mg·kg-1Se6+处理中苎麻生物量显著低于对照和Se4+处理。

叶绿素含量是决定植物光合能力的最重要因素之一，与生长环境密切相关；类胡萝卜素在光能吸收与传递及光系统保护中起着重要的作用；叶绿素a/b值（Chl a/b）或叶绿素/类胡萝卜素值（Chl/Car）变化均反映逆境条件下植物的生理状态和耐受性[34-35]。硒是谷胱甘肽过氧化物酶的必需组分，也参与辅酶A和辅酶Q的合成，在电子传递中起重要的作用，线粒体呼吸速率和叶绿体电子传递速率都与硒的存在与否及其含量有显著相关性，在一定浓度范围（＜0.10 mg·L-1）内，硒元素可以增强线粒体呼吸速率和叶绿体电子传递速率，超出阈值（≥1 mg·L-1）时则导致其速率降低[36]。硒对植物来说是一把双刃剑，在低浓度时是一种抗氧化剂，而在高浓度时是一种促氧化剂。Hawrylak-Nowak等[37]报道低浓度硒对黄瓜植株叶片光合色素含量无显著性影响，而高浓度硒显著降低其光合色素含量。Wang等[38]发现硒元素能够提高苎麻植物叶片类胡萝卜素的含量。本研究发现，硒酸钠对苎麻叶片光合色素含量的影响程度显著高于亚硒酸钠，即使低浓度（0.9 mg·kg-1）也能够造成苎麻叶片叶绿素和类胡萝卜素含量显著降低，造成苎麻的耐受力较差，导致Chl/Car值最低和Chl a/b值最高；而亚硒酸钠对苎麻前期叶片光合色素无显著性影响。这可能因为植物对亚硒酸钠的主要积累部位是根系，则运输至叶片时硒浓度大大降低；而植物对硒酸钠的主要积累部位是叶片，则容易对叶片产生毒害，抑制光合色素的合成。随着生育期的推进，亚硒酸钠处理中苎麻叶片光合色素含量高于对照，说明Se4+能通过降低植株叶片光合色素的分解，增加其耐受性从而缓解植物的衰老。

在环境胁迫下，细胞内生物自由基代谢平衡被破坏，造成超氧阴离子积累，进而引发或加剧膜脂过氧化作用，使得细胞膜系统的结构和功能劣变，新陈代谢发生紊乱[39]。本研究中亚硒酸钠在整个处理时期均未显著增加苎麻叶片超氧阴离子含量和产生速率，而硒酸钠在处理后10 d显著增加了苎麻叶片超氧阴离子含量和产生速率。有研究认为，硒的高毒性主要源于其作为氧化剂的作用，导致产生活性氧，对农作物有毒[40]，故1.8和2.7 mg·kg-1硒酸钠处理中，苎麻植株全部死亡，而0.9 mg·kg-1Se6+处理中苎麻生物量显著降低。植物抗氧化酶系统活性的变化及膜质过氧化作用能反映植物对逆境的响应，SOD、POD和CAT等组成的抗氧化系统是植物的重要保护机制，当植物遭受逆境胁迫时，植物体内SOD、CAT和POD活性迅速升高，有效清除活性氧自由基，保护细胞免受活性氧的伤害。SOD是植物抗氧化的第一道防线，将多余的超氧阴离子歧化为H2O2和O2，随后在CAT和POD的催化下使产生的H2O2歧化成无毒害的H2O和O2，最终清除超氧阴离子，减少逆境对植物的毒害[41]。同时，谷胱甘肽-S-转移酶（GSH-ST）是植物体中广泛存在的一种可催化还原型谷胱甘肽（GSH）与各种亲电子化合物进行亲核加成反应的一种多功能药物代谢Ⅱ相酶，是多种植物体内的主要解毒系统[42]。谷胱甘肽还原酶（GR）是一类黄素蛋白氧化还原酶，在真核生物和原核生物中都存在，其利用NADPH提供的电子将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原成GSH，从而维持还原型谷胱甘肽的含量，其活性的大小反映了植物体内抗氧化能力水平，在植物氧化胁迫过程中对活性氧的清除有非常重要的作用。还原型谷胱甘肽是细胞内最重要的抗氧化物，广泛存在于植物细胞中，由于其结构中活泼巯基的存在，从而成为植物体内主要的自由基清除剂，氧化脱氢后不需要酶催化直接可以迅速还原活性氧，并且GSH又可作为酶的底物，在GSHPX的作用下，把H2O2还原成H2O，自身被氧化为GSSG。Hartikainen等[43]报道，在幼苗中添加硒会降低SOD活性，但在较老的（衰老胁迫）黑麦草中会增加SOD活性；Xue等[44]在生菜中也得到了类似的结果。本研究中硒酸钠处理中因产生较多的超氧阴离子，从而显著提高了叶片中CAT、POD、GSHPX、GSH-ST和GR活性，以便达到清除活性氧、降低叶片中MDA含量、减少叶片膜质过氧化的作用，缓解其对植株的伤害，但对SOD活性均无显著性影响，则表明超氧阴离子的歧化主要通过谷胱甘肽酶系完成。此外，可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，其含量的增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。虽然亚硒酸钠在前期对叶片可溶性蛋白含量无明显影响，但随着生育期推进，其能够缓解可溶性蛋白含量的降低，从而延缓苎麻植株的衰老。

4 结论

硒酸钠对苎麻生理生化特性的影响程度远远大于亚硒酸钠，且其在植株体内易迁移，生物有效性强，更易造成植株伤害。当施用量大于1.8 mg·kg-1时造成苎麻幼苗死亡；当施用量为0.9 mg·kg-1硒酸钠时，虽然提高苎麻植株体内SOD、POD、GSH-PX和GR活力，但超氧阴离子含量和释放量最高，叶绿素和类胡萝卜素含量最低，抑制苎麻幼苗的生长，降低生物量。亚硒酸钠能够通过降低苎麻幼苗叶片光合色素的分解程度来缓解植株衰老，且能够一定程度降低膜质过氧化作用。因此，施用0.9 mg·kg-1亚硒酸钠在不影响苎麻生物量的同时能够显著提高硒含量和硒积累总量，并且能够缓解植株衰老。