一株淡水小球藻的分离纯化及鉴定

胡佳文，聂志娟，孙 毅，邵乃麟，李全杰，徐钢春

(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081)

绿藻广泛分布于淡水中，在海水中也有少量分布，种类繁多，包含小球藻、衣藻和团藻等。大多数绿藻都含有叶绿体，可进行光合自养，将二氧化碳、氮、磷等无机营养物质通过光合作用转变为高价值次生代谢物，如衣藻富含淀粉和油脂、小球藻含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸和多种维生素。因此绿藻可作食品、饲料、化妆品以及药业的重要原材料。绿藻物种丰富、分布广泛，在淡水中的藻类品种亦是繁多，为合理地对单一藻种进行深入研究和产业应用，需对淡水中的有益优势藻种进行分离纯化。本文从鲈鱼养殖水体中分离得到了一株土著绿藻优势种。通过光学显微镜观察，该土著藻种的形态特征与小球藻相似，经ITS基因序列分子鉴定为小球藻。

一、材料与方法

1.分离纯化

在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心扬中基地加州鲈养殖池塘中，采集经200目筛绢过滤除去大型浮游生物的水样置于三角锥形瓶中，加入无菌BG11培养液进行富集光照培养，1周后，显微镜下采用微吸管分离选取优势绿藻，并均匀涂布于LB 固体培养基。挑选生长较好的单一绿色藻落进行下一步的分离纯化至显微镜下无其他杂藻可见。培养温度(25±1)℃，光照周期夜∶昼＝12∶12，光照强度3000～5000勒克斯。

2.形态观察

该绿藻优势种经过分离纯化后，在LB 固体培养基上光照培养，观察藻落形态，在光学显微镜10 倍×40 倍下观察并拍照，依据形态学特征进行初步鉴定。

3.分子鉴定

(1)DNA 提取与扩增。采用6540-400 FastDNA Kit(Mpbio)试剂盒提取藻DNA。对ITS 基因序列进行PCR扩增。

引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’。

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR 反应体系(25 微升)：DNA 模板1.0 微升、引物各1.0 微升(引物浓度10 微摩/升)、Taq Master MIX 12.5 微升、dH2O 9.5 微升，定容至25微升。

PCR 反应程序：95℃5 秒，50℃10 秒，60℃150 秒，35 个循环，最后10℃保存。PCR 结束后从PCR仪上取下，待下一步处理。

(2)测序测定和分析。PCR 产物纯化回收后进行测序，将测序结果与NCBI 数据库中的序列进行BLAST在线比对分析，观察比对结果，找到与原序列相似度最高的序列，并下载相关序列。通过Mega-X 软件采用邻接法构建进化树，并建立遗传距离表，通过进化树的聚类结果进行物种鉴定与遗传关系分析。

二、结果

1.形态特征

光学显微镜观察及培养皿培养结果见图1。藻株直径在5～10微米。该藻株为单细胞藻，呈圆形或近圆形，表面光滑无凸起，无鞭毛。胞体鲜绿色。藻株在光学显微镜下的颜色、大小、形状都符合小球藻的特征，可初步判定分离的绿藻为小球藻。

图1 光学显微镜下藻株形态(左)及培养皿培养(右)

2.分子鉴定

实验中扩增到该土著绿藻优势种的ITS基因序列，大小约751 bp，序列在NCBI 中进行blast 同源性分析，结果显示该序列与GenBank 中36 条序列具有很高的同源性(96%～100%)。比对结果显示，与Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)的序列相似性最高，为100%，其次是Chlorella vulgaris isolate liming lake 1(MN103781.1)。获取同源序列后，使用megaX 内置的clustal W 进行多序列比对，使用NJ 模型构建进化树，设定bootstrap 为1000，选择Marvania coccoides CCAP 251/1A(FR865696.1)作为外类群。进化树结果显示，与Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)聚为一支，同源性最高，自展值为100%，统计置信度处于非常显著的水平且遗传距离最小，为0.0040。进化树结果与比对结果一致得出，分离纯化的优势绿藻种为chlorella sorokiniana isolate SM12_1，属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属。

三、讨论

本文通过微吸管分离和平板纯化分离出一株绿藻优势种，并通过形态学以及分子生物学鉴定明确了该藻株为小球藻。

本实验用显微镜观察藻株形态发现细胞壁、胞体直径、颜色等形态特征与小球藻相符。形态特征虽然是分类学的重要依据之一，但不一定精确。在水生生态系统中，许多浮游藻类存在表型可塑性，即一种基因型在不同的环境条件下呈现多种表型的现象(杨州，2008)。浮游藻类可能产生不同的表型以应对外界环境条件的变化，改变自身形态形成群体或集聚是最常见的一种形式(Huang，2018)。温度、pH、盐度等非生物因素可能诱导藻类发生形态变化，细菌、沉水性植物也可改变藻类表型。有研究发现金鱼藻对小球藻有显著的形态和生长效应(常孟阳，2019)。普通小球藻对菹草有形态响应，可促进小球藻群体的形成(常孟阳，2019)。因此，仅仅依据形态学来鉴定物种结果可能会出现差错。分子鉴定相比较形态学鉴定结果更精确。微藻体积微小，但对整个微藻进行DNA测序工作量大且成本高昂，因此通常选取特异性基因片段进行PCR扩增，将扩增产物克隆测序后与基因数据库中序列进行同源性比对，最终确定微藻的分类学地位。核基因组编码的ITS序列变异位点数量丰富(曲凌云，2008)，是一个理想的微藻鉴定基因。由于小球藻形态特征明显，综合考虑鉴别效率和精确性，可先通过形态学大致判定种类，再结合分子鉴定进一步确认。

小球藻培养过程中积累了大量蛋白质、脂质、多糖和类胡萝卜素等高价值代谢产物，是天然绿色的鱼苗开口饵料，也是虾类、贝类的优质饵料，还是用来培育供鱼苗摄食的动物性饵料如轮虫、枝角类等的优质基础饵料。此外，小球藻可以用来进行生物废水修复以及水质治理，治理效率高、成本低并且生态环保。因此，小球藻规模化定向稳定培养具有很大发展前景。本文分离纯化一株绿藻并鉴定为小球藻，助力绿色养殖模式建立，丰富小球藻种质资源，有助于推动小球藻规模化定向生产。