基于“药辅合一”的桉叶油乳膏的制备及药效研究

郭雪，陈金素，许蕊蕊，王秀丽*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021

桉叶油是桉树叶油腺细胞分泌的一种植物精油，主要药效成分包括桉叶油素、芳樟醇和α-蒎烯[1]。现代研究表明，桉叶油具有抗菌、消炎的作用，对炎症反应的多个环节，如体内炎性介质释放、毛细血管通透性增加等均有影响[2]，被广泛用于治疗肺结核、糖尿病、哮喘等疾病[3]。除此之外，桉叶油中还含有多种单萜类和倍半萜化合物及衍生物，这些萜类化合物均具有止血、止痛等作用[4]。

关于桉叶油的抗炎、抑菌、抗氧化和镇痛止痒活性已有较多研究[5-12]，但未见基于“药辅合一”的理念将桉叶油同时作为药效物质与油相、促透剂制成乳膏并对其抗炎、镇痛及抑菌效果进行研究的报道。

本研究基于“药之为辅”的设计应用规律，设计并优化了桉叶油乳膏的处方工艺。处方中的桉叶油为具有抗炎、抗菌作用的油状液体，替代乳膏中的有机溶剂充当油相，同时还可作为促透剂增加药物的经皮渗透性，兼有充当制剂油相、促进渗透与治疗疾病的三重特点。

乳膏剂的基质对皮肤表面分泌物的分泌和水分的蒸发影响较小，同时可以均匀溶解药物有效成分，涂抹于皮肤后可以使有效成分均匀释放，更好地发挥药物疗效。

鉴于此，本研究基于“药辅合一”的理念筛选桉叶油乳膏处方工艺，既发挥桉叶油抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛止痒等药理活性，又发挥其脂溶性和促渗透特性，拓展了桉叶油的应用范围，为植物挥发油作为药用辅料的进一步研究提供了参考。

1 材料

1.1 仪器

FA1204B 型分析天平（上海精密仪器仪表有限公司）；Sorall ST 8R 型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；SHHW21-600 型电热三用水箱（北京医疗设备厂有限责任公司）；BCD-519WEZ50型TCL 电冰箱（TCL 家用电器有限公司）；101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津赛得利斯实验仪器分析制造厂）；SDPTOP SZN 型解剖显微镜（尼康株式会社）；BBS-SDC 型超净台（济南鑫贝西生物技术有限公司）；挥发油提取器（河南九和共创仪器有限公司）；打孔器（上海远卓文教用品有限公司）。

1.2 试药

硬脂酸（批号：CG10070082，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；单硬脂酸甘油酯（批号：C10286479，上海麦克林生化科技有限公司）；甘油（批号：000619，北京化学试剂公司）；月桂氮䓬酮（批号：Z13J10Y93008，上海源叶生物科技有限公司）；十二烷基硫酸钠（批号：1202021，广东省精细化学品工程技术研究开发中心）；桉叶油（吉安骏马香料有限公司）；冰片（批号：76747220，上海迈瑞尔化学技术有限公司）；复方醋酸地塞米松乳膏（广州白云山医药集团股份有限公司白云山何济公制药厂）；二甲苯（批号：20091020，重庆川东化工集团有限公司）；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌（批号分别为19089037、17121207，北京北纳创联生物技术研究院）。

1.3 实验动物

SPF级昆明种小鼠120只，雄性，体质量18～22 g，生产许可证号：SCXK（京）2016-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，经过北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（BUCM-4-2019091004-3105），饲养于北京中医药大学动物房。

2 方法

2.1 Box-Behnken 响应面法优选桉叶油乳膏基质处方

2.1.1试验设计 预试验结果表明，桉叶油、硬脂酸及单硬脂酸甘油酯三者的用量会对桉叶油乳膏的质量产生较大影响。因此，正式试验中以桉叶油的用量（A）、硬脂酸的用量（B）和单硬脂酸甘油酯的用量（C）为自变量，以综合评分（Y）为评价指标，每个因素设计高、中、低3个水平，见表1。

表1 Box-Behnken响应面法优选桉叶油乳膏基质处方试验设计

2.1.2考察指标及评价方法 在桉叶油乳膏处方筛选过程中，将乳膏的外观均一性、涂抹延展性、离心稳定性、耐寒稳定性、耐热稳定性作为乳膏质量评价的指标，综合评分为5 个指标得分之和。各项指标的评价方法：1）外观均一性。观察桉叶油乳膏颜色、质地是否均匀，静置是否会产生分层现象；2）涂布延展性。观察桉叶油乳膏涂布过程中有无结块与颗粒；3）离心稳定性。将桉叶油乳膏4000 r·min-1离心15 min（离心半径为5 cm），观察是否发生分层、变色等油水分离现象；4）耐寒稳定性。取桉叶油乳膏于-20 ℃条件下放置24 h，取出放至室温，观察是否发生分层、变色等油水分离现象；5）耐热稳定性。取桉叶油乳膏置于50 ℃恒温箱中，恒温放置6 h，观察是否发生分层、变色等油水分离现象[13]，具体评分标准见表2。

表2 桉叶油乳膏基质评价标准

2.2 粒度测定

取3批桉叶油乳膏适量，涂成薄层，薄层面积相当于盖玻片的面积，覆以盖玻片，每个批号涂3 片，按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版（四部）附录通则0982第一法测定。

2.3 二甲苯致小鼠耳肿胀实验

昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为低、中、高剂量桉叶油乳膏组，阳性对照组及空白乳膏组5组，每组10 只。低、中、高剂量药物组按小鼠体质量分别在小鼠右耳耳廓给予桉叶油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1，阳性对照组在小鼠右耳耳廓均匀涂抹复方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1，空白乳膏组在小鼠右耳耳廓均匀涂抹空白乳膏1.0 g·kg-1，每天3次，连续3 d。第4 天涂药1 h 后，对各组小鼠右耳给予二甲苯致炎，每只0.05 mL，1 h 后将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用直径为8 mm打孔器将双耳相同部位打下圆耳片，称质量，以左耳作对照，左右耳片质量差为肿胀程度，计算各组肿胀度，求出肿胀抑制率。

2.4 热板实验

将热板仪的温度设置为（55.0±0.5）℃，将小鼠置于热板仪上，观察并记录从小鼠足底接触热板至出现舔后足的时间，将此时间定义为该小鼠的痛阈值，5 s＜痛阈值＜30 s 的小鼠为合格。选取痛阈值合格的小鼠50 只，随机分为低、中、高剂量桉叶油乳膏组、阳性对照组及空白乳膏组共5 组，每组10只。测定各组小鼠给药前痛阈值，然后低、中、高剂量药物组分别给予小鼠0.2、0.4、0.6 g/只桉叶油乳膏涂抹双后足，阳性对照组小鼠给予0.2 g/只的复方醋酸地塞米松乳膏，空白乳膏组小鼠给予0.2 g/只的空白乳膏。然后进行指标检测，连续给药2 次，每次间隔0.5 h，在末次给药1.0、1.5、2.0 h后测定其痛阈值，记录小鼠给药前后痛阈值并计算镇痛率[14]。

2.5 体外抑菌试验

从-80 ℃冰箱取冻存的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌种，室温解冻，在安全柜中用灭菌后的接种环蘸取少量菌液，在已冷却凝固的琼脂板上划线接种细菌，将划线的琼脂板置37 ℃恒温培养箱培养24 h。挑选单个生长状况良好的菌落接种于液体培养基中，37 ℃恒温振荡，培养箱中孵育6 h，再用灭菌后的液体培养基调整菌液吸光度为0.1后备用。

取无菌液体培养基20 mL 于直径为9 cm 的培养皿中，室温冷凝固化。取备用菌液50 μL，均匀涂布于培养基表面，用直径为6 mm的打孔器在中央位置打孔，并用所制高、中、低剂量的桉叶油乳膏填满缺孔，密封后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。取出测量抑菌环直径。每个剂量均设3个平行组。

2.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。实验数据均以（）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 处方优化试验结果

3.1.1Box-Behnken 响应面法优选处方试验设计及结果 Box-Behnken 响应面法优选处方试验设计结果见表3。

表3 桉叶油乳膏基质处方试验设计与评分结果

3.1.2模型拟合 采用Design-Expert V8.0.6.1 软件对上述数据进行分析，以Y对自变量进行模型拟合，并通过相关系数（r）等对拟合模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，得到回归方程：Y=93.40+3.25A+1.38B+2.63C-3.50AB-6.00AC-9.75BC-7.08A2-6.82B2-10.82C2，方差分析见表4。由此可知，r=0.968 6，P＜0.01，F值为24.01，这表明模型具有极显著差异性；失拟P=0.095 8＞0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，实验误差小，可用此模型对桉叶油乳膏处方进行分析和预测。

3.1.3响应面优化分析 根据拟合方程，通过Design-Expert V8.0.6.1 软件绘制评价指标随因素变化的等高线图和响应面图（图1～3）。

由图1～3 可以看出，桉叶油、硬脂酸和单硬脂酸甘油酯三者的用量对综合评分均呈抛物线形，即随着三者用量的逐渐增大，综合评分均呈现出先升高后降低的趋势，因此，在桉叶油乳膏的制备工艺中适当增加三者的用量可以提高综合评分。与此同时，由表4 可知，硬脂酸的用量对综合评分的影响小于桉叶油与单硬脂酸甘油酯的用量对综合评分的影响，随着硬脂酸用量的增加，综合评分先是升高，继而缓慢降低，因此，在桉叶油乳膏的制备中应控制硬脂酸的用量在最佳范围内。

图1 桉叶油用量和硬脂酸用量对综合评分的影响

表4 桉叶油乳膏多元回归模型方差分析结果

结合回归模型分析和实际操作过程中的可行性，各因素值保留为1位小数，桉叶油乳膏的最优基本基质配方：桉叶油的用量为1.1 g、硬脂酸的用量为1.0 g、单硬脂酸甘油酯的用量为1.6 g。

3.2 乳膏的制备

将硬脂酸1.0 g、单硬脂酸甘油酯1.6 g、桉叶油1.1 g、月桂氮䓬酮0.13 g、冰片2.0 g 放置于容器内，水浴加热至熔化，继续加热至70～80 ℃；另取十二烷基硫酸钠0.30 g、甘油0.75 g 和蒸馏水适量（加至乳膏总量10.0 g），加热至70～80 ℃，缓缓倒入硬脂酸等油相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷即得。空白乳膏的制备是将处方中的桉叶油用无药效作用的中链甘油三酸酯代替。中剂量乳膏中，含桉叶油0.80 g，中链甘油三酸酯0.30 g。低剂量乳膏中，含桉叶油0.60 g，中链甘油三酸酯0.50 g。

3.3 粒径考察结果

按照《中国药典》2020 年版（四部）附录通则0982 第一法测定粒径，3 批样品均未检出＞180 μm的粒子，结果见图4。

图4 3批桉叶油乳膏在40倍镜下的乳粒

3.4 桉叶油乳膏对二甲苯致炎反应的影响

结果表明，与空白乳膏组相比，低、中、高剂量桉叶油乳膏组及阳性对照组小鼠耳廓肿胀度均有明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。表明桉叶油乳膏能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎症，随着药物剂量的增大，抗炎效果逐渐增强，即具有剂量依赖性，且高剂量组的抗炎效果优于阳性对照组，提示桉叶油乳膏具有明显抗炎的作用，结果见表5。

表5 桉叶油乳膏对小鼠的抗炎作用结果（,n=10）

表5 桉叶油乳膏对小鼠的抗炎作用结果（,n=10）

注：与空白乳膏组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；表6同。

图2 桉叶油用量和单硬脂酸甘油酯用量对综合评分的影响

图3 硬脂酸用量和单硬脂酸甘油酯用量对综合评分的影响

3.5 桉叶油乳膏对物理性致痛的影响

结果表明，高剂量和中剂量的桉叶油乳膏都能明显提高小鼠的痛阈值，提高小鼠对热板的耐受力，2 个剂量组都与空白乳膏组有明显差异，且中剂量组提高小鼠通阈值的能力与阳性对照组相当，高剂量组优于阳性对照组，顺序为高剂量组＞阳性对照组＞中剂量组＞低剂量组，具体结果见表6。

表6 桉叶油乳膏对小鼠的镇痛作用结果（,n=10）

表6 桉叶油乳膏对小鼠的镇痛作用结果（,n=10）

3.6 桉叶油乳膏体外抑菌效果

抑菌圈直径6 mm即为与打孔器直径相同，无抑菌作用。抑菌圈直径越大，抑菌作用越强。当给予低剂量桉叶油乳膏时，其对大肠埃希氏菌的抑菌圈只有6.22 mm，有微弱的抑菌作用，而中高剂量的桉叶油乳膏对大肠埃希氏菌的抑菌圈明显增大。相比于大肠埃希氏菌，桉叶油乳膏对金黄色葡萄球菌的抑制作用有所增强，高剂量组抑菌圈能达到9.50 mm，抑菌效果明显，结果见表7。

表7 桉叶油乳膏抑菌作用（,n=3）

表7 桉叶油乳膏抑菌作用（,n=3）

4 讨论

角质层主要由角质细胞和大量填充于细胞间隙的类脂组成，是药物透皮吸收的主要屏障。桉叶油的主要成分1,8-桉叶素为无色或黄色澄清液体，化学性质稳定，具有良好的脂溶性，容易穿透生物膜结构，现有研究表明，桉叶油是通过改变角质细胞间类脂双分子层结构，增加其紊乱程度从而促进药物渗透的[15]。因此，桉叶油不仅作为主要的有效成分在乳膏中发挥了抗炎、镇痛与抑菌的作用，还作为乳膏的主要油相基质与促透剂起到了构建乳膏与促进乳膏透皮吸收的作用。

从制剂角度看，桉叶油特殊的理化性质在桉叶油乳膏中充当了辅料角色，充分利用其脂溶性、抑菌剂和促透剂的功能特征，辅助制剂的成型、渗透与稳定，减少了化学辅料在乳膏中的应用，提高了制剂的安全性和患者的顺应性，一举多得；从治疗角度看，桉叶油可以发挥抗炎、镇痛的作用，符合“药辅合一”的理论内涵，为桉叶油的开发和医用提供了广阔前景。

5 结论

综上所述，本研究通过二甲苯致小鼠耳肿胀、热板仪小鼠致痛及大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制实验探讨了桉叶油乳膏的抗炎、镇痛及抑菌的药理作用。由实验结果可知，本研究所制桉叶油乳膏的抗二甲苯致小鼠耳肿胀炎症作用优于临床上常用的消炎止痒药方醋酸地塞米松乳膏，且可明显提高小鼠痛阈值，效果同样优于阳性对照组。抑菌实验表明，桉叶油乳膏对金黄色葡萄球菌与大肠埃希氏菌均有一定程度的抑制作用。桉叶油乳膏抗炎、镇痛作用优良，且兼具一定的抑菌作用。