血清外泌体miR-21诊断心肌梗死后心室重塑的价值

卢凯 余红

心肌梗死后常伴随心室重塑，由此导致的心脏泵衰竭可反复发作，心血管事件发生率明显增加，尽早寻找到能够反映心肌梗死后心室重塑的指标，对指导临床治疗、疗效评估及预后分析具有重要价值。近年来，研究发现了一种由细胞分泌的外泌体，是一种100 nm左右大小的囊泡，可以作为细胞的“信使”，拥有传递生物信息的作用，广泛存在于唾液、尿液、血液等体液中，可用于诊断、治疗疾病［1］。在不同病理生理状态下，循环中外泌体内含物会有明显改变，心肌梗死后循环中外泌体的表达谱亦明显改变［2］。miR-21被发现参与心肌纤维化过程［3］，而心肌梗死后循环中外泌体miR-21的改变尚未有报道。笔者通过观察心肌梗死后心室重塑患者循环中外泌体miR-21的变化，探讨其与心室重塑指标和心功能的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 连续收集2017年1月至2019年12月在湖州市第一人民医院确诊的心肌梗死后心室重塑患者102例，作为观察组。（1）纳入标准：符合心肌梗死的诊断标准［4］；心功能NYHA分级在II～IV级；可配合完成研究调查；临床资料完整。（2）排除标准：处于疾病终末期；存在多脏器功能衰竭、严重感染、合并恶性肿瘤者；既往有心肌梗死病史；不能配合研究者。其中，男50例，女52例；年龄（62.8±10.2）岁。另随机选取同期来院进行健康体检者50例，作为对照组。其中，男25例，女25例；年龄（63.40±9.80）岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 研究方法 （1）收集资料：包括血常规、血脂、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）等实验室检查指标和左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室舒张末期容积（left ventricular end systolic volume，LVEDV）等心脏超声检查参数。（2）血清外泌体提取及鉴定：使用血清外泌体提取试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司），按照试剂盒说明进行操作。收集的外泌体样品采用蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体表面标记CD63、CD9的表达，应用电镜观察外泌体的形态及大小。（3）外泌体miR-21的提取与测定：采用TRIzol RNA分离试剂（美国赛默飞公司）提取外泌体总RNA，并监测RNA纯度，以吸光度＞1.80 D用于后续检测；采用miR反转录试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）将总RNA反转录为cDNA；应用荧光定量PCR仪（美国ABI公司）比较两组血清外泌体中miR-21的表达差异，SYBR RT-PCR试剂购自日本TaKaRa公司，以线虫cel-miR-39（广州锐博生物科技有限公司）作为内参。采用相对Cq法（△Cq）分析miR-21表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以［n（%）］表示，采用χ2检验；外泌体miR-21表达与LVEF、BNP、LVEDD、LVEDV等心脏超声参数进行Pearson相关性分析；构建受试者工作特征（ROC）曲线分析外泌体miR-21对心肌梗死合并心室重塑的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的基线资料比较 组间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表1。

表1 两组的基线资料比较

2.2 两组血清外泌体的鉴定 电镜下观察到的外泌体是一种直径约100 nm，具有双层膜结构的囊泡（图1A），与文献报道相同［5］。Western blot检测外泌体表面标记蛋白CD63、CD9，见图1B。

图1 血清外泌体的鉴定

2.3 两组的血清外泌体miR-21表达水平比较 观察组的血清外泌体miR-21相对表达水平（50.70±3.78）显著高于对照组（3.17±0.62），差异有统计学意义（t=6.752，P＜0.001）。

2.4 心肌梗死后心室重塑患者循环中外泌体miR-21与NYHA心功能分级的关系 按照NYHA心功能分级进行分组，发现随着心功能等级的加重，外泌体miR-21水平明显增加，提示外泌体miR-21水平与心功能恶化、患者病情严重程度相关。见表2。

表2 外泌体miR-21表达水平与NYHA心功能分级的关系

2.5 两组的心室重塑指标比较 观察组心脏超声的LVEDV、LVEDD明显高于对照组，而LVEF低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组的心室重塑指标比较（±s）

表3 两组的心室重塑指标比较（±s）

项目 对照组（n=50） 观察组（n=102） t值 P值LVEDV（mL） 85.43±13.14 105.45±24.73 3.452 0.041 LVEDD（mm） 48.14±2.52 58.74±3.72 1.823 0.038 LVEF（%） 65.14±4.12 50.41±6.23 1.675 0.044

2.6 血清外泌体miR-21与各临床指标的相关性分析外泌体miR-21与LVEF呈负相关（r=-0.653，P=0.032），与BNP呈正相关（r=0.545，P=0.044），与LVEDD呈正相关（r=0.672，P=0.041），与LVEDV呈正相关（r=0.641，P=0.021）。

2.7 外泌体miR-21对心肌梗死合并心室重塑的诊断价值 外泌体miR-21对心肌梗死后心室重塑的ROC曲线线下面积（AUC）为0.876（95%CI 0.789～0.962），在最佳截断值处的灵敏度为83.30%、特异度为80.00%。见图2。

图2 外泌体miR-21诊断心肌梗死合并心室重塑的ROC曲线

3 讨论

随着心肌梗死早期冠状动脉血运重建术的开展，心肌梗死的病死率逐渐降低，尽管结合规范的药物治疗，但这部分存活下来的患者的远期并发症较多，心血管事件的再发生率及住院率仍较高［6］，可能与心肌细胞坏死、凋亡导致不可逆的心室重塑有关，主要表现为进行性发展、心室扩张，最终导致不可逆的心功能不全［7］。临床上，早期无严重并发症的心肌梗死患者无明显心室重塑的表现，部分患者以并发急性心力衰竭再入院，因此寻找兼具特异度和灵敏度的血清指标对心肌梗死后并发心室重塑的诊疗具有重要意义。研究发现，心肌梗死后循环中外泌体内含物发生改变，并参与心脏损伤及修复的过程［8］，因此通过观察外泌体的改变可能有助于早期发现心肌梗死后的心室重塑。

微小RNA（miR）是一类具有转录后调控功能的非编码RNA，由20多个核苷酸组成，参与真核细胞基因表达、分化、发育等生理过程［9］。近年来，miR在疾病生理病理中的作用以及临床诊断价值逐渐被发现，比如循环miR用于肿瘤诊断及预后预测的价值得到提升、心肌梗死后异常升高的miR可能辅助临床诊断等［10-12］。因此，循环miR的改变可能成为未来心血管疾病诊断的重要标志物。但部分miR可能由于外泌体的包裹，导致其单纯在循环中的表达可能不高［13］，但又可能在疾病的发生发展过程中发挥重要作用，因此监测这部分miR的表达改变对理解疾病的病理生理过程至关重要。

miR-21最初是在心脏成纤维细胞中选择性表达被发现，参与心衰患者心脏结构和功能的改变［14-15］，而抑制miR-21的表达可以逆转心室重塑［16-17］。研究发现，miR-21在冠心病患者血清中的表达明显增高，尤其是发生心肌梗死的患者［18］，miR-21可能参与加剧心肌纤维化进程来促进心肌梗死后心室重塑的过程［19］。本研究发现，心肌梗死后心室重塑患者的血清外泌体miR-21表达水平显著升高，且与疾病严重程度相关，心功能等级越差则其表达越高。进一步分析发现，外泌体miR-21的表达与BNP、LVEDD、LVEDV存在正相关，与LEVF呈负相关，提示外泌体miR-21参与心肌梗死后心室重塑的病理生理过程，外泌体miR-21表达升高亦提示预后不良。而且，外泌体miR-21诊断心肌梗死后心室重塑的ROC曲线的AUC值为0.876（0.789，0.962），在最佳截断值处的灵敏度为83.30%、特异度为80.00%。由此可见，外泌体miR-21对诊断心肌梗死后心室重塑具有较高的特异度和灵敏度，值得临床上推广应用。

综上所述，血清外泌体miR-21水平的升高与心肌梗死后并发心室重塑相关，特异度、灵敏度均较高，可以作为心肌梗死后预测心室重塑的指标。