微量元素与生长因子对L-苯丙氨酸发酵的影响

陈志超，王金多，徐庆阳,2,3*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)2(天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津，300457) 3(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津，300457)

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)与L-酪氨酸(L-tyrosine，L-Tyr)、L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)同属芳香族氨基酸，为莽草酸途径产物之一[1-2]。可作为新型甜味剂阿斯巴甜的合成前体[3]，也可作为抗癌药物的载体[4]，在食品与医药方面具有极大的应用价值，目前常采用微生物发酵法获取[5]。

微生物利用葡萄糖等为碳源合成L-Phe的代谢途径较长，需要经过糖酵解途径(glycolytic pathway，EMP)、柠檬酸(tricarboxylic acid，TCA)循环、戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPP)与莽草酸途径(shikimic acid pathway)，其中多个关键酶与L-Phe的合成关系密切。金属离子作为重要的酶激活剂，其种类与用量影响到关键酶活力的强弱进而影响到L-Phe 产量与糖酸转化率。金属离子对酶的激活/抑制作用机理错综复杂，表现为：不添加或添加过少的金属离子无法对酶起激活作用，如5×10-3～10×10-3moL/L的Mg2+可激活NADH+合酶，但低于或高于此浓度均无法起到激活作用；金属离子对酶的作用具有一定的选择性，如Ca2+对肌球蛋白腺三磷酸起到激活作用，却对脱羧酶有抑制作用；有时离子之间也有拮抗作用，如Ca2+可以抑制Mg2+激活的酶，再者金属离子之间也可以相互取代，如Mn2+离子可以取代Mg2+激活的激酶[6]。核黄素(维生素B2)在生物体内是重要辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)的合成前体[7]，FAD和FMN作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用[8]。磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)是细胞140多种酶的辅酶，在氨基酸的合成、相互转化和降解等代谢反应中起重要作用，常见的反应包括：催化α-酮酸转化为氨基酸的转氨酶以及一系列的消旋作用、脱羧作用和羟醛反应[9]。维生素H过量会导致菌体代谢旺盛[10]，生长过快，出现糖酸转化率大幅降低的问题；过少或者不添加维生素H会导致菌体生长较慢、生物量较低，产酸效率偏低等问题。

为解决上述问题，本研究对L-Phe发酵中使用的微量元素与生长因子(Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、PLP、维生素B2、维生素H，以下统称为微量元素)用量进行了优化调整，以关键酶活力、L-Phe产量与糖酸转化率等为指标，展示了优化后微量元素用量的优越性，解决了微量元素用量粗放的问题，对工业化微生物发酵生产L-Phe具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

L-Phe大肠杆菌生产菌，天津科技大学代谢工程实验室。

1.2 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉4，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO42.0，硫酸铵2.0，维生素B11×10-3，FeSO4·7H2O 1×10-2，MnSO4·H2O 5×10-3，维生素H 1×10-3，酪氨酸1.5，卡那霉素20。

发酵培养基(g/L):葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，酵母粉4.5，蛋白胨1.5，硫酸铵2，K2HPO4·3H2O 6，酪氨酸1.2，谷氨酸1.2，维生素B1、维生素B3、维生素B5、维生素B122.5 mL/L，维生素H 0～2×10-3，FeSO4·7H2O 0～40×10-3，MnSO4·H2O 0～25×10-3，CaCl2·2H2O 0～33×10-3，CuSO4·5H2O 0～0.7 ×10-3，CoCl2·6H2O 0～60×10-3，ZnSO40～3×10-3，维生素B20～10×10-3，PLP 0～10×10-3，卡那霉素1×10-2。

1.3 仪器与设备

LDZH-100KBS型全自动立式蒸汽灭菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L自动控制发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；SBA-40E生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；Agilent1200高效液相色谱仪、Agilent Technologies；752分光光度计，上海分析仪器厂；OLYMPUS生物显微镜，日本OLYMPUS会社；S-433D氨基酸分析仪，德国赛卡姆公司。

1.4 培养方法

1.4.1 菌种活化

取甘油保菌管中菌株置于固体斜面培养基上，于37 ℃恒温培养12 h，传代2次。

1.4.2 摇瓶、5 L发酵罐培养

参考文献[10]。

1.5 检测与分析方法

1.5.1 pH、溶氧值、生物量、温度值测定

参考文献[11]。

1.5.2L-Phe及副产物测定

发酵液中L-Phe、丙氨酸(L-alanine,L-Ala)产量采用LC20AT高效液相色谱仪测定[12]，乙酸检测参考文献[13]，谷氨酸使用SBA生物传感分析仪测定。

1.5.3 酶粗液提取

取发酵液，4 ℃、6 500 r/min低速低温离心6 min，弃上清液，收集菌体，称量菌体湿重。利用0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液冲洗菌体2次，离心后弃上清液，再次使用该溶液重悬。利用超声细胞破碎仪破碎细胞，过程持续冰浴，将处理后的液体离心，取上清液即为酶粗液。

1.5.4 DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸转氨酶(tyrB编码)酶活测定

参考文献[14-16]，其中DAHP又称3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinone glycolic acid-7-phosphate synthetase，DAHP)，CM为分支酸变位酶(chorismate mutase, CM)，PDT为预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase, PDT)。

1.5.5 酶活力定义方式

本实验所测酶活力定义方式均为：1 g鲜重菌体在1 mL反应体系中1 h产生1 μmoL产物定义为1个酶活力单位[μmoL/(h·g鲜重)]。

1.5.6 残糖测定及耗糖速率、转化率计算

参考文献[17]。

1.5.7 单因素试验用量表

按表1所示微量元素设置10组实验，每组添加单一微量元素，设置5个浓度梯度与3个平行实验，实验结果取3组平行实验平均值，特别指出，鉴于自来水中Ca2+、Mg2+离子含量较多，因此实验用水均为纯净水。

表1 微量元素及其用量Table 1 Trace elements and their dosage

1.5.8 正交试验探究部分微量元素与生长因子的最适浓度

如表2所示，本部分实验在单因素试验结果的基础上设置5个因素4个水平的正交试验L16(54)，对起较大影响作用的PLP、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、维生素B2、CoCl2·6H2O 5种微量元素的用量通过正交试验进一步优化研究。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Level table of orthogonal experimental factors

2 结果与分析

2.1 添加单一微量元素对发酵的影响

如图1所示，以CuSO4·5H2O、CoCl2·2H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O为例，实验涉及的10种微量元素对L-Phe产量的影响主要有4种形式：(1)CuSO4·5H2O 添加量≤0.47×10-3g/L时，产量较对照组(11.2 g/L)有一定提高，当添加量达到1.17×10-3g/L时，产量较对照组降低了7.1%；(2)CoCl2·2H2O 质量浓度≤6×10-3g/L时，产量随添加量提高而提高，在6×10-3g/L时产量为14.9 g/L，较对照组提升了33.0%，当添加量提高到8×10-3g/L时，产量相对稳定，未出现明显的升降趋势，具有类似效果的还有NiCl2·6H2O、PLP、维生素B2；(3)ZnSO4、CaCl2·2H2O的添加对L-Phe的产量没有明显的影响，不具备分析意义；(4)FeSO4·7H2O添加量≤3×10-2g/L时，产量随添加量的升高而升高，且在添加3×10-2g/L时产量为18.2 g/L，较对照组提高了62.5%，当添加量>3×10-2g/L时，产量出现一定程度的下滑，但始终高于对照组，具有类似效果的还有MnSO4·H2O、维生素H。值得注意的是，单一添加MnSO4·H2O时发酵液颜色随着MnSO4·H2O添加量的提高而变黑，检测得知生成大量乙酸，因此也可以认为添加MnSO4·H2O的实验组中L-Phe产量的下降和乙酸的积累具有直接关系。

图1 单一微量元素对L-Phe产量的影响Fig.1 Effect of single trace element on the yield of L-phenylalanine 注：A、B、C、D指相应微量元素不同浓度梯度

如图2所示，FeSO4·7H2O、维生素H对生物量的影响较大，Fe2+在电子传递、氧的传递、TCA循环、基因调控和DNA的生物合成等生物学过程具有重要作用[18]，因此不难解释FeSO4·7H2O对生物量的正向作用，当过量添加时，铁在有氧条件下并不利于微生物生长，氧气和还原氧类可以与铁反应对生命产生破坏性的影响[19]，因此在添加量为30×10-3g/L时生物量为66.4，继续添加时生物量降低；维生素H可在脂肪酸生物合成、氨基酸代谢和糖异生的羧化反应中作为酶促辅因子，例如作为乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成[20]，后者作为细胞膜的主要成分，是限制细胞生长的主要因素，因此维生素H的添加量越高，生物量越大，但涨幅逐渐降低，其中添加2×10-3g/L的实验组，生物量为62.0，较对照组提高了19%。MnSO4·H2O的添加同样对生物量起到了促进作用，Mn2+离子在EMP中作为多个关键酶的辅因子，影响糖的利用进而影响到能量代谢，进一步影响到微生物的生长代谢，不过在Mg2+存在时，这种促进作用并不明显。其他微量元素相对FeSO4·7H2O、维生素H、MnSO4·H2O对生物量的影响并不明显，但适量添加时还是会有一定的促进作用。

图2 单一微量元素对生物量的影响Fig.2 Effect of single trace element on biomass

2.2 微量元素缺失对发酵的影响

2.2.1 微量元素缺失对产量、转化率、生物量的影响

综合2.1中的实验结果，认为CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、维生素B2、维生素H最适添加量分别为1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、3×10-2、1.5×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3、1×10-3g/L，在均添加最适浓度的前提下，以实验涉及的10种微量元素全部添加为对照组，探究微量元素单一缺失对发酵的影响，结果取3组平行实验平均值，如图3所示。

图3 微量元素缺失对发酵的影响Fig.3 Effect of lack of trace elements on fermentation 注：横坐标代表缺失对应的微量元素的实验组

如图3所示，从生物量差异来看，FeSO4·7H2O、维生素H的缺失对生物量影响最大，较对照组分别降低了10.0%、10.6%，剩余8种微量元素对生物量影响并不显著，因此可以看出FeSO4·7H2O、维生素H在菌体生长过程中的必要性，且不能通过添加其他微量元素弥补；从L-Phe产量来看，MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O的缺失对产量的影响最为显著，分别较对照组降低了15.0%、10.1%，其次是CoCl2·6H2O、PLP，当两者缺失时产量较对照组分别降低了7.0%、8.5%，Mn2+、Fe2+和Co2+离子作为NADH酶的酶激活剂[21-22]，能够很大程度上提高L-Phe的产量，即使报道[21]称Mn2+能够优先与NADH酶结合，但本实验证明了Mn2+、Fe2+、Co2+的单独缺失均会影响L-Phe的产量。PLP的缺失也影响到了最终产量，推测该物质可作为其他关键酶的辅酶，进而影响L-Phe的产量。其他微量元素的缺失并未造成明显的产量下降，其中CuSO4·5H2O的缺失反而使得产量较对照组提高了2.1%；从糖酸转化率来看，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、维生素B2的缺失分别使得糖酸转化率较对照组下降了2.8%、4.6%、3.5%、6.3%、2.8%，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP对转化率造成的影响与产量的变化趋势相同，因此认为转化率下降是由于产量下降引起，维生素B2是生物体内一些氧化还原酶的辅基，对电子传递、脱氢等反应具有催化作用，可以认为维生素B2促进了菌体的能量代谢，进而提高了糖酸转化率，但其具体作用机制还待研究。维生素H的缺失很大程度上提高了糖酸转换率，较对照组提高了8.5%，对应菌体量下降明显，即使在2.1的结果中证明了维生素H单一存在可以一定程度的提升L-Phe的产量，但这种提升完全能够被其他微量元素替代，因此外源添加维生素H并不适合大肠杆菌发酵生产L-Phe。

2.2.2 微量元素缺失对酶活力的影响

L-Phe合成途径中的限速酶为DAHP、CM、PDT[4]，最终生成的苯丙酮酸在芳香族氨基酸转氨酶的作用下生成L-Phe，因此将上述4种酶统称为关键酶。

根据2.1中的结果得知，实验涉及的10种微量元素对提高L-Phe产量的影响顺序为：MnSO4·H2O>FeSO4·7H2O>CoCl2·6H2O>PLP>维生素B2>维生素H>>NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后4位不分先后，且远远小于前6位)；对提高L-Phe糖酸转化率的影响顺序为：PLP>FeSO4·7H2O>MnSO4·H2O>维生素B2、CoCl2·6H2O>>维生素H、NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后5位不分先后，且远远小于前5位)，因此默认对实验结果影响较小的NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4以通过单因素试验得到了最佳添加量，并猜测CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、维生素B2为L-phe合成途径中关键酶的辅酶或辅因子，因此本部分实验以5种物质均添加最适用量作为对照组，单一缺失任意一种为实验组，取样检测4种关键酶的酶活力，实验结果如图4所示。

图4 微量元素缺失对酶活力的影响Fig.4 Effect of lack of trace elements on enzyme activity

如图4所示，对照组DAHP酶活力为4 347.3 μmoL/(h·g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力较对照组下降了21.5%，MnSO4·H2O的缺失使得酶活力下降了23.4%，证明了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O的不可缺少性，其余微量元素的缺失并未引起酶活力的明显下降；对照组CM酶活力为3 292.5 μmoL/(h·g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力较对照组下降了35.2%，其余微量元素并未引起酶活力的明显下降，因此可以认为CM是Fe2+依赖性的；对照组PDT酶活力为3 321.4 μmoL/(h.g)，FeSO4·7H2O的缺失使得酶活力下降了33.6%，这与CM情况类似，因此认为Fe2+对CM-PDT是至关重要的辅因子；对照组芳香族氨基酸转氨酶活力为3 813.8 μmoL/(h·g)，PLP的缺失使得酶活力下降了39.3%，因此认为PLP是芳香族氨基酸转氨酶至关重要的辅因子。维生素B2的缺失使得每个酶相对对照组均出现了一定程度的下降，但未引起某个具体的关键酶活力的明显下降，认为维生素B2作为氧化脱氢类酶的辅酶，并不能直接影响到芳香族氨基酸的生成，但能在EMP、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，HMP)等途径中加快能量代谢，从而间接提高L-Phe的产量与转化率。CoCl2·6H2O的缺失使得DAHP、CM活力轻微下降，并未影响到其他3种酶的活力，但结合2.2.1中结论，CoCl2·6H2O的缺失使得产量与转化率均下降明显，推测该物质可作为莽草酸途径相关酶的辅因子，从而影响到L-Phe的生成。

2.3 正交分析探究关键微量元素的最适用量

2.2.2的实验结果证明了CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、维生素B2为L-Phe发酵过程中的关键因素，因此本研究继续对这5种物质的用量进行优化，结果如表3所示。

表3 L-Phe产量正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment on L-Phe yield

如表3所示，从产量均值来看，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、维生素B2的最适添加量分别为28×10-3、14.0×10-3、5.5×10-3、10×10-3、6.5×10-3g/L，由产量极差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O为影响L-Phe产量的主要因素，其中MnSO4·H2O为关键因素。因素CoCl2·6H2O、PLP、维生素B2极差均较小，对产量的影响并不显著，为次要因素；由转化率均值可知，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、维生素B2的最适添加量分别为2.8×10-2、1.45×10-2、5.5×10-3、1×10-3、5.5×10-3g/L。由转化率极差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP为影响糖酸转化率的主要因素，其中FeSO4·7H2O为关键因素。因素CoCl2·6H2O、维生素B2极差较小，对转化率的影响并不显著，为次要因素。

综合来看，FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP用量的进一步优化对产量与转化率有较大影响，因素FeSO4·7H2O在2.8×10-2g/L时两项均值均为最大，因素MnSO4·H2O取1.4×10-2g/L时产量均值最大，取1.45×10-2g/L时转化率均值最大，因此可有选择性的选择MnSO4·H2O的添加量，PLP取1×10-2g/L时产量均值最大，取9.5×10-3g/L时转化率均值最大，但PLP对转化率的影响远大于对产量的影响，因此选取9.5×10-3g/L为最适添加量。CoCl2·6H2O、维生素B2的浓度变化在本部分实验中并未明显影响到转化率与产量，因此可以认为二者已达最适用量，再次优化并无意义。

2.4 5 L发酵罐发酵验证

前期实验确定了维生素H对L-Phe发酵的不利影响，得知了其余9种微量元素的最适添加量，但由于摇瓶发酵具有较大的局限性，因此在之前实验的基础上，以CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、维生素B2分别添加1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、2.8×10-2、1.4×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3g/L为实验组，以不添加微量元素作为对照实验，使用5 L发酵罐进行发酵实验，检验前期微量元素用量优化结果。

2.4.1 微量元素对生物量与耗糖速率的影响

由图5可知，实验组生物量与耗糖速率在发酵过程中始终高于对照组，最大生物量122.8远远大于对照组最大生物量101.3，达到最大耗糖速率的时间比对照组提前了4 h，但在数值上相近；在发酵进行到34 h时，对照组生物量开始呈现下降趋势，耗糖速率也呈现大幅度的下滑，此时实验组生物量与耗糖速率均处于稳定期；当发酵进行到40 h，对照组几乎无法继续摄糖，生物量持续下降，无法继续进行发酵，此时实验组生物量依据处于稳定期，但耗糖速率有所下降；发酵50 h，实验组生物量依旧没有明显的下降趋势，但此时耗糖速率下降严重，因此结束发酵，发酵周期较对照组延长了10 h。

图5 耗糖速率与生物量过程变化Fig.5 Variation of sugar consumption rate and biomass in fermentation process

2.4.2 微量元素对L-Phe产量及实时转化率的影响

实时转换率是指发酵进行到某一时刻时，在该时刻生产的总酸与总糖之比，该数据可体现出发酵过程中各个时间段的产酸效率，因此设法延长高效率时期或者提高最大实时转化率均有利于L-Phe的发酵生产。

由图6可知，当微量元素缺失时，L-Phe产量总体偏低，且增加趋势平稳，最终产量为56.4 g/L，这与转化率曲线趋势大致相同，整体呈上升趋势，在22～26 h出现下降趋势，这是因为L-Phe在临近结晶浓度时会形成松软的假晶体状态[23]，同时伴随大量的发酵泡沫，此时难以继续生成L-Phe，但菌体持续耗糖，导致转化率下降；实验组产量在经历了0～20 h的缓慢积累后，在20～35 h达到了产酸的高峰期，之后增长速度减缓，但总量依旧在增长，最终产量为85.4 g/L，较对照组增加了51.4%。实验组实时转化率曲线波动程度较对照组较大，在0～6 h急剧上升，由于种子液培养时间较长，因此在接发酵后菌体立即开始产酸，且此时菌体扩增速度较缓慢，转换率急剧上升，在6 h后，生物量开始迅速增加，虽然产酸也在增加，但大部分葡萄糖用于菌体生长，因此糖酸转化率呈现下降趋势，在24 h前后，产量接近结晶浓度，与对照组相同，此时转化率进一步下降，当L-Phe结晶后，菌体进入产酸高峰期，此时转化率与产量均迅速增加，直至发酵后期(40 h后)产酸速率再次减缓，但耗糖速率下降并不明显，转化率再次降低，最终转化率为26.3%，远大于对照组的21.4%，即使实验组转化率曲线波动较大，但在整个发酵过程中，实时转化率均高于对照组，因此实验组更具优势。

图6 实时转化率与产量过程变化Fig.6 Variation of real-time conversion rate and yield in fermentation process

2.4.3 微量元素对副产物的影响

取发酵结束时发酵液进行副产物含量检测，结果如图7所示。

实验组产生了0.8 g/L的乙酸、1.2 g/L的谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)与0.2 g/L的L-Trp，均不会对菌体的生长代谢以及后续提取造成影响。对照组乙酸含量为6.7 g/L，此时的乙酸含量可严重影响菌体的生长代谢，是对照组发酵后期生物量迅速下降的主要原因；L-Glus与L-Trp含量达到了3.3、1.4 g/L，分别比对照组增加了175%、600%，既影响转化率，又提高了后续分离提取难度；对照组发酵液中检测出来了L-Ala(1.8 g/L)，这在实验组并未检出，推测是由于莽草酸途径关键酶活力不够，导致糖酵解途径大量积累丙酮酸，而丙酮酸作为L-Ala的直接前体，经过一步反应即可生成L-Ala，通常来讲L-Ala只作为氨基酸代谢的中间体，难以积累[24]，但对照组在发酵后期衰亡严重，菌体几乎无法进行代谢反应，使得L-Ala能够少量积累。

图7 副产物产量对比Fig.7 Comparison of by-product yield

3 结论

金属离子、维生素等微量元素可在微生物众多代谢途径中起到关键作用，如作为关键酶的辅酶、辅因子，或者作为反应前体物质的载体等，L-Phe作为莽草酸途径的主要代谢产物，其合成路径长、副产物多，涉及的酶促反应较多，因此对微量元素的种类及用量要求较高，本研究通过单因素试验、正交试验、发酵罐验证实验，以关键酶活力、L-Phe产量、糖酸转化率、副产物含量等为指标，对L-Phe发酵涉及的微量元素种类及用量进行优化了，最终确定的种类为及用量分别为：CaCl2·2H2O 1.1×10-2g/L、CuSO4·5H2O 4.7×10-4g/L、CoCl2·6H2O 6×10-3g/L、ZnSO46 ×10-4g/L、FeSO4·7H2O 2.8×10-2g/L、MnSO4·H2O 1.4×10-2g/L、NiCl2·6H2O 6.06×10-3g/L、PLP 9.5×10-3g/L、维生素B26×10-3g/L。以不添加微量元素为对照组，优化后产酸期明显延长，DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸转氨酶的酶活力显著提高，生物量(OD600)达到了122.8，较对照组提高了17.5%，L-Phe产量达到了85.4 g/L，较对照组提高了51.4%，糖酸转化率达到了26.3%，较对照组提高了18.6%，副产物种类与含量均远低于对照。本实验确定了维生素B2对L-Phe发酵的促进作用与生物素(维生素H)的负面影响，针对性优化了CoCl2·6H2O、PLP的用量，进一步优化了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O等微量元素的用量。最终L-Phe产量较文献[4]最高记载提高了4.5%，这对L-Phe的工业化生产具有积极意义。