核心蛋白聚糖在胰腺癌beta细胞功能中的作用及对线粒体分离融合的影响*

张 荣，吕海龙，杨一邨，王浩斌，黄江涛，张 抒

(四川省成都市第三人民医院普外科 610031)

胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤之一。其预后差，生存率低[1]。随着我国人口老龄化和糖尿病发病率的升高，胰腺癌将成为危害我国国民健康的重大疾病之一[2]。然而，目前关于胰腺癌依旧缺乏行之有效的诊断和治疗手段[1-2]。胰腺癌常分为胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)和胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumors，PNET)。最新证据显示，占据胰腺癌95%的PDAC与代谢紊乱导致的骨骼肌、脂肪和肿瘤细胞消耗增加密切相关[3-4]。但目前对胰腺癌的代谢和分子机制尚未阐明。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是富含亮氨酸的小蛋白聚糖家族的重要成员[5]。研究报道，DCN具有调控癌细胞和内皮细胞增殖、凋亡，巨噬细胞极化和小鼠糖耐受等作用[6-7]。DCN通过过氧化物酶体增殖物激活的受体γ共激活分子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，PGC1-α)调控米托他汀诱导乳腺癌细胞的线粒体自稳[8]。DCN可诱导血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)依赖性的线粒体片段化和线粒体膜电位的丧失[5]。DCN介导的抑癌作用作为上皮癌潜在的未来辅助疗法具有重要价值[9]。线粒体的分离融合是细胞生长及其功能的代谢基础。然而，DCN与线粒体的分离融合在胰腺癌发生发展中的作用尚未见报道。本研究通过研究胰腺癌组织中DCN的表达和其对胰岛β细胞线粒体的分离融合的影响与分子机制，以揭示DCN和胰腺癌胰β细胞岛线粒体的分离融合失衡间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

征集2018年6月至 2021 年2月本院诊断为PDAC患者21例(PDAC组)，PNET患者25例(PNET组)及健康志愿者4例(健康组)。收集患者肿瘤组织及健康志愿者胰腺组织。(1)PCAC及PENET患者诊断和纳入标准：手术前未经放化疗等任何形式的治疗；经影像学诊断且肿瘤标志物CA19-9阳性。(2)排除标准：合并其他恶性肿瘤及存在严重器质性疾病者；伴精神疾病者或认知障碍者。PDAC组患者年龄(49.65±5.85)岁；PNET组患者年龄(52.96±8.85)岁。健康组人群的年龄(40.21±4.33)岁。本文研究经本院伦理委员会审核批准，所有患者、志愿者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学检测

组织置于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水、包埋并切片、脱蜡和水化。采用柠檬酸缓冲液高温修复30 min。加入兔抗人DCN多克隆抗体(1∶200，武汉三鹰生物技术有限公司)，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500，武汉Abclonal公司)，室温孵育 1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色1 min，自来水冲洗5 min。ddH2O漂洗5 min。常规复染，脱水，透明和封片。采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色情况。

1.3 免疫荧光检测

组织置于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水、包埋并切片、脱蜡和水化。采用柠檬酸缓冲液高温修复30 min。加入兔抗人MFN2多克隆抗体和小鼠抗人DRP1多克隆抗体(1∶200，武汉三鹰生物技术有限公司)，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，每次5 min。加入FITC和CoraLite594标记的二抗(1∶500，武汉三鹰生物技术有限公司)，室温孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI染色30 s，PBS漂洗3次，每次5 min。抗荧光淬灭剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)封片，荧光显微镜拍照，采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色面积。

1.4 小鼠胰岛β细胞培养及分组

小鼠胰岛β细胞NIT-1在含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。胰酶消化重悬，悬液500×g 4 ℃离心10 min后计数并接种至细胞培养板中，置于37 ℃ 5% CO2孵箱培养24 h后，更换2% 胎牛血清培养基培养6 h同步化，更换完全培养基，依次加入0、1、10、100和200 nmol/L DCN处理0、12、24和48 h。或更换为含0 nmol/L或100 nmol/L的DCN(D8428，美国Sigma-Aldrich)的正常葡萄糖培养基或高糖(HG)培养基(武汉塞维尔生物科技有限公司)培养24 h,分为正常糖条件下的0 nmol/L DCN组、10 nmol/L DCN组和高糖条件下的0 nmol/L DCN组、10 nmol/L DCN组。

1.5 CCK-8实验

细胞增殖实验采用CCK-8比色法检测，参照CCK-8试剂盒说明书，细胞经消化计数后，以2×103/孔的细胞数接种细胞至96孔培养板中，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混匀后培养2 h后于450 nmol/L处检测各孔光密度(OD)值，绘制细胞增殖曲线图。

1.6 流式细胞实验

对数生长期的细胞经消化计数后，以5×104/孔的数接种细胞至12孔培养板中，37 ℃ 5% CO2培养24 h后，更换为HG培养基(武汉塞维尔生物科技有限公司)和(或)100 nmol/L的PCN培养24 h。每孔细胞以乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化收集细胞，冷PBS洗涤3次，细胞沉淀加入1% BSA 400 μL重悬后，加入2.5 μL Annexin V-FITC抗体(上海碧云天生物科技有限公司),室温孵育30 min,PBS洗涤1次，400 μL PBS重悬后加入2.5 μL 碘化丙啶(PI)染料(武汉塞维尔生物科技有限公司)，并使用LSR-Ⅱ流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)进行检测。使用FlowJo软件对结果进行分析。

1.7 胰岛素检测实验

取细胞培养上清液100 μL，按胰岛素ELISA检测试剂盒(上海碧云天生物)使用说明书操作，使用BioTek 5.0酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.8 Western blot检测

取组织加入1 mL含蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液(武汉塞维尔生物科技有限公司)，组织置于玻璃组织匀浆器中，于冰上充分碾碎组织，冰上孵育10 min。收集至1.5 mL Ep管中，超声10 s，2个循环。14 000×g 4 ℃离心 20 min后收集上清。细胞加入0.5 mL含蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上孵育10 min，收集至1.5 mL Ep管中，超声 10 s，2个循环。14 000×g 4 ℃离心 20 min后收集上清液。上清液采用BCA法检测蛋白浓度并95 ℃干热变性10 min。组织以60 μg总蛋白，细胞以30 μg总蛋白上样量行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，200 mA恒流湿转2 h至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，5% BSA的TBST溶液室温封闭1 h，加入一抗DCN、线粒体分裂因子(MFF)、线粒体融合蛋白1(MFN1)、MFN-2、视神经萎缩症蛋白1(OPA1)、动力相关蛋白1(DRP1)、线粒体分裂蛋白1(FIS1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(P22phox)、丝裂原活化蛋白激酶p38亚基(p38)、胰岛素样生长因子Ⅰ受体蛋白(IGFIR)、蛋白激酶B(AKT)和β-actin(1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000，武汉三鹰生物技术有限公司)及磷酸化AKT(p-AKT)和p-p38(1∶500，1∶500，武汉Abclonal公司)于4 ℃摇床孵育12 h，第2天TBST室温漂洗3次，每次5 min。室温孵育二抗(1∶5 000，武汉三鹰生物技术有限公司)2 h，TBST室温漂洗3次，每次5 min。ECL(武汉塞维尔生物科技有限公司)发光显影。蛋白表达ImageJ软件分析灰度值，以β-actin为内参。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 胰腺癌患者组织中DCN的表达比较

免疫组织化学染色结果显示，与健康组[(47.34±8.21)%]比较，PDAC组 [(36.81±11.15)%] 和PNET组 [(8.02±1.19 )%] 患者癌组织中DCN表达水平明显降低，差异有统计学意义(P=0.008，P=0.003)，见图1A、B。Western blot结果显示，PDAC组(3.23±0.75)和PNET组(1.20±0.37)患者癌组织中DCN表达水平和明显低于与健康组(5.22±1.21)，差异有统计学意义(P=0.009，P=0.002)，见图1C、D。

2.2 胰腺癌患者组织中线粒体功能比较

免疫荧光结果显示PDAC组和PNET组患者胰腺癌组织胰岛中MFN2表达水平分别为(22.64±8.34)%和(75.89±9.37)%，明显高于健康组胰腺组织(9.73±0.51)%(P=0.042，P=0.010)；DRP1表达水平分别为(38.31±5.97)%和(19.93±7.21)%，明显低于健康组(50.23±11.90)%(P=0.039，P=0.022)，见图2A、B。Western blot结果显示，线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2和OPA在PNET组胰腺癌组织(1.15±0.5,1.68±0.2和1.01±0.10)和PDAC组胰腺癌组织(1.19±0.40,0.79±0.30、0.65±0.20)中的表达水平明显高于健康组胰腺组织(0.56±0.20，0.58±0.10、0.25±0.05)，其中PNET组vs.健康组P=0.045、0.047、0.041；PDAC组vs.健康组P=0.042、0.049、0.024；线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1和MFF在PNET组胰腺癌组织(0.82±0.12，0.68±0.15、0.95±0.13)和PDAC组胰腺癌组织(0.79±0.34，0.67±0.22、1.85±0.49)中的表达水平明显低于健康组胰腺组织(1.52±0.18、1.98±0.20和2.64±0.40)，其中PNET组vs.健康组P=0.035、0.021、0.044；PDAC组vs. 健康组P=0.039、0.025、0.047。见图2C、D。

2.3 DCN对胰岛β细胞增殖的影响

在正常糖条件下，相较于24和48 h的0 nmol/L DCN组(增殖倍数均为1)，100 nmol/L DCN组(3.75±0.18，3.96±0.16)和200 nmol/L DCN组(2.21±0.18，2.36±0.16)的细胞增殖倍数明显增加(24 h：P=0.035、0.016；48 h：P=0.045、0.033)，见图3A。在正常糖条件下，100 nmol/L DCN组的(5.22±0.42)细胞增殖倍数明显高于0 nmol/L DCN组(3.96±0.42),P=0.012。在HG条件下，100 nmol/L DCN组的(2.16±0.16)细胞增殖倍数明显高于0 nmol/L DCN组(1.36±0.16)，P=0.009，见图3B。

A：DCN表达免疫组织化学代表图(200×)；B：免疫组织化学统计分析图；C：DCN Western blot图；D：Western blot统计分析图；a：P<0.01。

2.4 DCN对胰岛β细胞凋亡的影响

在正常糖条件下，100 nmol/L DCN组[(1.54±0.16)%]的AnnexinV+PI-细胞比例与0 nmol/L DCN组[(1.25±0.15)%]比较无明显变化(P=0.165)。在HG条件下，100 nmol/L DCN组(1.65±0.16)%的AnnexinV+PI-细胞比例与0 nmol/L DCN组[(2.68±0.56)%]比较，差异无统计学意义(P=0.472)，见图4A、B。

A：MFN2和DRP1免疫荧光染色图(100×)；B：免疫荧光分析统计图；C：Western blot代表图；D：Western blot统计分析图；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.5 DCN对胰岛β细胞胰岛素分泌和线粒体分裂、融合的影响

在正常糖和HG条件下，100 nmol/L DCN组细胞培养上清液中的胰岛素分泌量分别为(4.65±0.25)μg/mL和(1.75±0.18) μg/mL，分别高于正常糖条件下[(3.75±0.25) μg/mL]和HG条件下[(1.21±0.18) μg/mL]0 nmol/L DCN组，差异有统计学意义(P=0.042，P=0.049)，见图5A。在正常糖条件下，相较于0 nmol/L DCN组(0.85±0.15、0.68±0.15、1.32±0.12)，100 nmol/L DCN组(2.58±0.16、1.71±0.16、2.50±0.25)的线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1和MFF表达水平明显增加(P=0.012、0.034、0.013)。在正常糖条件下，相较于0 nmol/L DCN组(1.15±0.15、1.68±0.14、1.16±0.12)，100 nmol/L DCN组(0.56±0.20、0.58±0.10、0.25±0.05)的线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2和OPA表达水平明显减少(P=0.042、P=0.015、P=0.024)。在HG条件下，相较于0 nmol/L DCN组(1.45±0.43)，100 nmol/L DCN组(1.12±0.18)的线粒体分裂相关蛋白DRP1表达水平明显减少(P=0.048)；在HG条件下，相较于0 nmol/L DCN组(2.45±0.20、1.19±0.10)，100 nmol/L DCN组(0.62±0.26、0.82±0.16)的线粒体融合相关蛋白MFN2和OPA表达明显减少，差异有统计学意义(P=0.014和P=0.041)，见图5B、C。

A:细胞增殖倍数统计图；B：正常糖和HG条件下细胞增殖倍数统计图；a：P<0.05；b：P<0.01。

A：流式细胞图； B：流式细胞统计图；a：P<0.05。

A、C：Western blot图；B、D：Western blot统计分析图；a：P<0.05；b：P<0.01。

2.6 DCN对P22phox/MAPK通路和IGFIR/AKT通路的影响

在正常糖和HG条件下，相较于0 nmol/L DCN组，100 nmol/L DCN 组的P22phox[正常糖条件：1.52±0.18vs.2.58±0.16,P=0.031；HG条件：0.22±0.12vs.0.55±0.05,P=0.024)和p-p38(正常糖条件：1.08±0.20vs.1.91±0.16,P=0.024；HG条件：0.48±0.15vs. 0.98±0.15,P=0.025)表达水平明显增加，差异有统计学意义，见图6A、B。在正常糖和HG条件下，0 nmol/L DCN组和100 nmol/L DCN 组的IGFIR蛋白表达水平无明显变化(正常糖条件：P=0.961；HG条件：P=0.879)，见图6C、D；在正常糖下，100 nmol/L DCN组p-AKT蛋白(1.56±0.15)表达水平明显高于0 nmol/L DCN组(0.56±0.20)，差异有统计学意义(P=0.019)，见图6C、D。

A、C：Western blot图；B、D：Western blot统计分析图；a：P<0.05。

3 讨 论

近年来，越来越多的证据表明，重新编程的代谢可能在胰腺癌的发生发展、治疗和预后中起关键作用[10]。研究报道，线粒体融合过程可以使胰腺癌破碎的线粒体正常化，并降低氧化磷酸化，从而抑制肿瘤生长和改善患者的存活率[11]。在哺乳动物中，线粒体是众所周知的重要细胞器，线粒体的分裂融合在能量代谢和细胞存活中具有重要作用[12]。且人重组DCN能够抑制胰腺癌细胞的生长[13]。然而，胰腺癌中DCN的表达变化及DCN对胰岛细胞线粒体的分裂、融合的影响目前尚未见报道。

本研究证明了PDAC和PNET患者癌组织中DCN表达水平明显降低，并且，主要定位表达于胰岛部位。因此，DCN可能与胰岛β细胞的生长和功能密切相关。其次，通过检测线粒体融合相关蛋白(MFN1、MFN2和OPA)和线粒体分裂相关蛋白(DRP1、FIS1和MFF)表达发现，PDAC和PNET患者胰岛可能存在线粒体融合增加和线粒体分裂减少。这可能导致胰岛细胞生长和功能受损，胰岛素分泌不足，这与早期报道的MFN2抑制胰腺癌细胞的增殖和促进细胞凋亡结果一致[14-15]。MFN2将线粒体和内质网功能与胰岛素信号传导联系在一起，对于正常的葡萄糖稳态是必不可少的[16]。本研究发现，DCN可促进胰岛β细胞增殖，并在HG条件下，抑制胰岛β细胞凋亡。同时，DCN在正常糖条件下促进线粒体分裂，抑制线粒体融合，而在HG条件下，DCN抑制线粒体分裂和线粒体融合。提示，DCN可能通过调控线粒体分裂融合影响胰岛β细胞生长和胰岛素释放。在HG中，胰岛β细胞呈现高度的胰岛素抵抗、糖耐受和AKT表达水平下调。因此，DCN可能进一步下调HG环境线粒体分裂、融合。研究报道，DCN可调控P22phox/MAPK通路和IGFIR/AKT通路影响细胞生长和功能[5,17]。本研究结果显示，在正常糖条件下，DCN上调胰岛β细胞P22phox/MAPK通路和p-AKT表达，但不影响IGFIR表达。在HG条件下，DCN上调胰岛β细胞P22phox/MAPK通路，但不影响IGFIR/AKT通路。说明，DCN具有调控胰岛β细胞P22phox/MAPK通路介导线粒体分裂、融合的作用，继而在正常糖和HG条件促进胰岛β细胞增殖。提示，在胰腺癌中下调的DCN可能参与调控线粒体分裂、融合影响胰岛β细胞功能，继而影响胰腺癌的发生发展。

综上所述，DCN低表达于PDAC和PNET患者胰岛β细胞，且与胰岛β细胞线粒体融合分裂失衡密切相关。DCN可激活P22phox/MAPK通路，调控线粒体分裂、融合参与胰岛β细胞的胰岛素分泌和细胞增殖。从蛋白水平可知，DCN促进正常糖条件下胰岛β细胞的线粒体分裂并抑制融合，同时，DCN抑制HG条件下胰岛β细胞的线粒体分裂、融合，且DCN对正常糖和HG条件下均激活P22phox/MAPK信号。但在HG条件下DCN介导的P22phox/MAPK通路激活如何同时影响调控胰岛β细胞的线粒体分裂、融合尚需进一步研究。