同源四倍体‘五月慢’的诱导鉴定

王红尧,潘静雯,周贺芳,徐园园,张蜀宁,侯喜林,刘同坤*

(1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/南京农业大学园艺学院,南京 210095;2淮南市农业科学研究所,淮南 232001)

可育多倍体的形成可促进物种间的遗传物质交流,丰富物种多样性,为多倍体育种的发展奠定基础[1]。“巨型性”是多倍体植物的特征之一,相较于二倍体植物,其品质明显提升,适应性和抗逆性显著增强[2]。约有75%的被子植物和95%的蕨类植物在进化过程中经历过多倍化[3]。自然形成的多倍体大多是物种为适应环境,在长期的自然选择中进化而来[4]。但自然诱变环境难于模拟,人工合成多倍体便是明晰植物进化历史的极佳选择[5]。

不结球白菜(Brassica campestrisssp.chinensisMakino)原产于中国,已有六千年以上的栽培历史[6]。我国南方地区常称其为青菜,北方地区称其为油菜。我国同源四倍体不结球白菜的研究开始于1980年,刘惠吉等[7]诱导出同源四倍体‘矮脚黄’,发现其品质明显高于二倍体植株。李艳艳[8]诱导出优质同源四倍体‘黄心乌’。王夏等[9]诱导出优质同源四倍体‘华凤’。彭丹[10]诱导出耐热同源四倍体‘夏帝’、‘烤青’。二倍体‘五月慢’种植面积较大,抽薹晚,解决了部分长江中下游地区“春淡季”市场不结球白菜紧缺问题,但是二倍体‘五月慢’抗性弱、产量低,远不能满足广大消费者对叶菜类的需要[11]。本试验用一定浓度的秋水仙素溶液诱导二倍体‘五月慢’,以期获得高产、优质、晚抽薹的同源四倍体‘五月慢’材料,为不结球白菜多倍体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以南京农业大学白菜系统生物学实验室提供的二倍体‘五月慢’(2n=2x=20)为试验材料,试验地点为南京农业大学白菜系统生物学实验室以及南京农业大学句容实验基地。

1.2 诱导方法

‘五月慢’幼苗子叶完全展开时,参考前人[12-14]的方法,用质量浓度为0.2%的秋水仙素溶液点滴幼苗生长点,每天上午(9:00)和下午(17:00)各处理1次,每次滴50μL,共处理3 d。

1.3 鉴定方法

1.3.1 形态学观察

观察叶型、叶色、叶厚、花器官、种荚、种子等相关形态学性状进行初步筛选,再通过解剖学方法观察气孔、花粉的形态特征等。

1.3.2 细胞学鉴定

将种子置于有湿润试纸的培养皿中催芽,待其生根后取1—2 cm根尖,放入蒸馏水中,4℃条件下静置24 h,卡诺固定液(无水酒精、冰醋酸体积比3∶1,现配)固定24 h,60℃条件下使用1 mol/L HCl解离4 min。采用压片法制片,使用卡宝品红染液(Solarbio)进行染色,在Olympus倒置显微镜(型号:IX73;生产商:奥林巴斯)100倍镜下观察染色体并拍照。

1.3.3 流式细胞仪倍性鉴定

利用流式细胞仪检测植株DNA相对含量并进行分析鉴定。取0.1 g植株幼嫩叶片,在装有1 mL提取液A(MgSO4缓冲液中加入1%PVP)的玻璃培养皿中快速切碎(冰上进行);过40μm滤筛后取滤液,5 000 r/min、4℃条件下离心5 min,弃上清液;加入1 mL提取液A,震荡并重复前一步骤;加入500μL提取液B(MgSO4缓冲液中加入荧光染料和核糖核酸酶,现配),充分混匀后避光染色15 min,使用流式细胞仪(型号:cytoFLEX;生产商:贝克曼库尔特)检测。

1.4 二倍体和四倍体‘五月慢’营养品质分析以及农艺性状调查

2018年10月播种,2019年3月8日进行品质及农艺性状统计。二倍体和四倍体‘五月慢’植株各选取10株,取各植株同一部位的叶片,测定其硝态氮含量、可溶性蛋白含量、氨基酸含量、可溶性糖含量、纤维素含量、叶绿素浓度及花青苷含量[15],并测量株高、叶数、叶宽、柄宽、叶长、柄长、单株质量[16]等农艺性状。

1.5 数据分析

采用Excel 2019软件进行数据整理,使用SPSSStatistics 20软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 二倍体和四倍体‘五月慢’植株的形态学分析

由图1可知,与二倍体‘五月慢’植株相比,四倍体‘五月慢’植株束腰明显,叶片紧凑、开展度较小,叶色较深、叶面较褶皱;四倍体‘五月慢’花序花簇变大、花朵紧凑;花朵变大,单花花瓣更圆,颜色更加明艳,花器官个体较大;种荚变粗,种子直径变大;花粉呈明显棒状,且可见少量梯形、圆形等不规则花粉;叶片下表皮气孔密度变小、形态变大。

图1 二倍体、四倍体‘五月慢’植株各器官Fig.1 Organs of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.2 二倍体和四倍体‘五月慢’植株细胞学分析

由图2可知,根尖染色体鉴定结果显示二倍体‘五月慢’的染色体数目为20,四倍体‘五月慢’根尖染色体数目为40。

图2 二倍体、四倍体‘五月慢’细胞学鉴定Fig.2 The cytological identification of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.3 流式细胞仪倍性分析

由图3可知,二倍体‘五月慢’的DNA相对含量在70左右。四倍体‘五月慢’的DNA相对含量在140左右,约为二倍体的2倍。

图3 二倍体、四倍体‘五月慢’DNA相对含量Fig.3 DNA relative content of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.4 二倍体和四倍体‘五月慢’营养品质分析

由表1可知,四倍体‘五月慢’植株中硝态氮含量、纤维素含量分别比二倍体降低了24.03%、31.84%,差异极显著;可溶性蛋白含量、花青苷含量分别比二倍体增加了43.94%、37.08%,差异极显著。相较于二倍体,四倍体植株叶绿素含量上升13.89%,可溶性糖含量上升9.76%,呈显著差异;氨基酸含量上升14.33%,无显著差异。

表1 二倍体、四倍体‘五月慢’营养品质比较Table 1 Comparison of nutritional quality between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.5 二倍体和四倍体‘五月慢’农艺性状分析

由表2可知,四倍体‘五月慢’植株株高、叶数、叶长、叶柄长分别比二倍体植株下降了4.78%、21.05%、4.14%、3.71%,且株高、叶柄长差异达极显著水平;相较于二倍体植株,四倍体植株单株质量、十叶厚、叶宽、叶柄宽分别上升了22.63%、39.39%、2.85%、16.88%。

表2 二倍体、四倍体‘五月慢’主要农艺学性状比较Table 2 Comparison of main agronomic traits between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

3 讨论

染色体的同源倍数越多,细胞、细胞核的体积越大,叶片大小、厚度,气孔和花粉粒大小,花和种子大小以及茎的粗度也随之递增,这种特征称为多倍体的巨大性[17]。形态学鉴定方法直观且操作简便,可用于多倍体的初步鉴定。但形态学鉴定误差大,结合细胞学及流式细胞仪鉴定可提高准确率。

与二倍体植物相比,多倍体植物通常表现出明显的生长优势,如生长迅速、适应性更强、组织器官更大等[18]。本研究显示,相较于二倍体‘五月慢’,同源四倍体植株花簇、花朵、花器官、果荚、种子等均体现出巨大性,与张宇等[19]、王夏等[9]的研究结论一致,但株高等未明显体现出此特性。

叶绿素是植物叶片中主要的光合色素,是植物进行光合作用的物质基础,叶绿素含量是决定作物光合效率和生物量的重要因素[20]。本试验中,四倍体‘五月慢’叶色深于二倍体,叶绿素总含量比二倍体植株高13.89%,可溶性糖含量增加9.76%。

叶类蔬菜中极易富集硝酸盐,且人体内摄入的硝酸盐80%以上来自蔬菜[21],虽然硝酸盐对人体无直接危害,但是其在人体内可被还原成亚硝酸盐,其与人体血红蛋白结合会引发亚硝酸盐中毒,还可能与次级胺反应生成致癌性亚硝酸胺[22-24]。本试验中,四倍体‘五月慢’植株的硝酸盐含量比二倍体‘五月慢’低。同源四倍体减数分裂行为异常是其育性降低的原因[25],本试验中,同源四倍体‘五月慢’结种率下降,但种质仍然具有较好育性。

4 结论

本研究成功诱导出四倍体‘五月慢’,发现该四倍体具有束腰性强、植株矮化、叶色鲜亮、抽薹晚、产量高等优势。且可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量、叶绿素含量、花青苷含量较高,纤维素含量、硝酸盐含量较低。