槲皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

林雪梅 王小林 唐春红

[摘要]目的探討棚皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法将54只雄性SD大鼠随机分成三组：假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+棚皮素组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2 h，再灌注24 h;假手术组仅暴露左侧颈总动脉后缝合。缺血再灌注+棚皮素组大鼠在缺血30 min后腹腔注射棚皮素50 mg/kg，假手术组及缺血再灌注组大鼠按相同方式给予等体积溶剂。再灌注24 h后评价大鼠神经功能状态、脑组织含水量，观察脑组织形态学变化，制备脑组织匀浆并测定脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果腹腔注射棚皮素后，大鼠神经功能评分降低、脑组织含水量下降、脑组织内SOD活性增加、MDA含量降低、脑组织损害减轻，差异有统计学意义（P<0.05）。结论棚皮素可通过调节抗氧化途径保护脑缺血再灌注引起的神经损伤。

[关键词]缺血再灌注;抗氧化;槲皮素;神经保护

[中图分类号]R285.5    [文献标识码]A    [文章编号]2095-0616（2022）01-0024-04

Protective effect of quercetin on focal cerebral ischemia­reperfusion injury in rats

LIN Xuemei1，2    WANG Xiaolin1，2    TANG Chunhong2

1. Section of Pathology Teaching and Research，North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China;2. Department of Pathology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effect and mechanism of quercetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods A total of 54 male SD rats were randomly divided into 3 groups，which were the sham operation group，the ischemia-reperfusion group，and the ischemia-reperfusion plus quercetin group. The model of focal cerebral ischemia in rats with middle cerebral artery occlusion was made by suture method，and the model was ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h. In the sham operation group，only common carotid artery was exposed and sutured. Rats in the ischemia-reperfusion plus quercetin group were injected with quercetin 50 mg/kg intraperitoneally after ischemia for 30 min，while rats in the sham operation group and the ischemia-reperfusion group were treated with the same volume of solvent in the same way. 24 h after reperfusion，the neurological function and water content of brain tissue were evaluated，the morphological changes of brain tissue were observed，the homogenate of brain tissue was prepared，and the activity of superoxide dismutase （SOD）and the contents of malondialdehyde （MDA）in brain tissue were detected. Results After intraperitoneal injection of quercetin，the neurological function score of rats decreased，the water content of brain tissue descended，the activity of SOD in brain tissue increased，the content of MDA decreased and the damage of brain tissue alleviated，with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Quercetin can protect neurological injury caused by cerebral ischemia-reperfusion by regulating antioxidant pathway.

[Key words]Ischemia-reperfusion;Antioxidant;Quercetin;Neuroprotection

缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損伤是指器官血流减少或中断，随后血流再灌注及细胞复氧，从而引起组织细胞损伤[1-2]，这一损伤过程涉及氧自由基的生成[3]、钙离子内流[4]、补体激活[5]、toll样受体激活和炎症反应[6-9]等多种复杂机制。槲皮素作为一种强自由基清除剂[10]，不断地被用于全身各器官缺血再灌注损伤模型保护性研究，包括心、肝、肾、睾丸、骨骼肌等[11]。实验数据表明槲皮素可通过多种途径发挥脑缺血再灌注损伤保护作用，包括激活凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径抑制神经细胞凋亡[12]、减少白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症递质抑制炎症反应[13]、下调基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9）维持血脑屏障完整性[14]及以提高脑组织内硫氧还蛋白含量发挥抗氧化应激[15]等。虽然槲皮素已经被运用于脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究，但相关治疗临床前研究指南指出，在脑缺血性损伤的药物研究中应选择多重指标[16]。故本研究采用局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察槲皮素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

1    材料与方法

1.1    实验动物和主要试剂

雄性SD大鼠由川北医学院实验动物中心提供，重量为250～300 g。槲皮素购自美国Sigma-Aldrich，纯度≥98%。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司。

1.2    药物和实验动物的准备

雄性SD大鼠54只，随机分成三组：假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+槲皮素组，每组各18只。将槲皮素溶解于二甲基亚砜，配制药物浓度50 mg/ml备用。按50 mg/kg剂量在缺血30 min后经腹腔注射给予缺血再灌注+槲皮素组大鼠药物，假手术组和缺血再灌注组则按相同方式给予等体积溶剂。

1.3    动物模型的制备

用线栓法制备动物模型。用石蜡包裹、头端呈梭形的0.24 mm鱼线做线栓。术前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射0.35%水合氯醛麻醉（0.1 ml/kg）大鼠，暴露左侧颈总动脉，在颈总动脉壁剪一破口，线栓经破口插入颈内动脉，过颈动脉分叉处继续进线约2 cm时稍感阻力，提示线栓已经到达左侧大脑中动脉并阻断大鼠左侧大脑中动脉血流，造成大鼠左侧脑组织缺血性损伤。随即将线栓固定在颈总动脉，缝合伤口。栓塞缺血2 h后退出线栓再灌注24 h。假手术组大鼠仅暴露左侧颈总动脉后缝合。

1.4    神经功能评分

再灌注24 h后，根据Zea-longa评分标准[15]观察大鼠行为学变化并评分：无神经缺损症状为0分;不能伸展右侧前爪为1分;行走时向右侧转圈为2分;行走时向右侧倾倒为3分;不能自发行走，意识丧失为4分。1～3分为有效模型。

1.5    脑组织含水量测定

每组6只，大鼠脑缺血再灌注24 h后，断头取脑，去除脑表面的硬脊膜、小脑及脑干部分，立即用微量精密天平称取大脑组织重量，然后放入烘箱，80℃烘72 h至恒重，称取干重。脑含水量=（脑湿重-脑干重）/脑湿重×100%。

1.6    大鼠脑皮质形态学观察

每组6只，大鼠脑缺血再灌注24 h后，断头取脑，10%福尔马林溶液固定24 h，取材、固定、脱水、包埋、3 μm切片后行苏木素-尹红染色。

1.7    脑组织内SOD活性及MDA含量测定

每组6只，大鼠脑缺血再灌注24 h后，断头取脑，剪取少量颜色晦暗、肿胀区域（即梗死区）脑组织称重，然后置于匀浆器中进行手工匀浆，制备10%脑组织匀浆，2000 r/min离心15 min，取其上清液，参照南京建成生物技术有限公司试剂盒操作说明检测脑组织匀浆中SOD活性及MDA含量。

1.8    统计学处理

2    结果

2.1    槲皮素对各组大鼠神经功能评分及脑组织含水量的影响

与缺血再灌注组比较，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能显著降低大鼠神经功能评分及脑含水量，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2    槲皮素对各组大鼠脑组织SOD活性及MDA含量的影响

与缺血再灌注组比较，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能显著提高脑组织内SOD活性及降低MDA含量，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.3    槲皮素对各组大鼠脑皮质形态学改变的影响

假手术组大鼠脑皮质细胞排列整齐、形态结构正常、组织间质均匀红染无异常。缺血再灌注组大鼠脑皮质细胞数量减少、排列紊乱、可见核固缩及细胞水肿、组织间质内网状结构疏松淡染、并见小空泡。与缺血再灌注组比较，腹腔注射50 mg/kg槲皮素后，大鼠脑皮质细胞数量增多、密度增加，发生核固缩和水肿的细胞数量均减少，组织间质水肿程度减轻。见图1。

3    讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，廣泛存在于各种蔬菜水果中，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗感染、抗肿瘤、扩张血管、治疗代谢性和心血管疾病等多种药用价值[17]。研究表明其对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但根据相关治疗临床前研究指南，在脑缺血性损伤的药物研究中除了选择多重指标外，其评价应包括组织和行为学结果[16]。发生脑缺血再灌注时，血管通透性增强，血管源性脑水肿形成;随着细胞复氧，线粒体功能受损，活性氧生成增加，从而诱导一系列氧化应激反应，导致细胞水肿、凋亡甚至梗死[18]，故而动物可出现一系列异常的神经行为学表现。因此，本研究量化统计大鼠神经功能评分、评价脑组织含水量、观察脑组织形态学变化，可以反映大鼠脑缺血再灌注的损伤程度。

与缺血再灌注组比较，腹腔注射槲皮素后，大鼠神经功能评分和脑组织含水量均明显下降。提示槲皮素能改善脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损害及脑水肿。此外，发生脑缺血再灌注损伤后，脑组织损伤体现为细胞数量减少、核固缩、细胞水肿，脑组织间质内网状结构疏松淡染及小空泡形成。而腹腔注射槲皮素后，脑皮质细胞数量增多、密度增加、核固缩和水肿细胞数量均减少，脑组织间质水肿程度减轻，这些形态学改变与大鼠的神经功能评分及脑组织含水量改变趋势是一致的，提示槲皮素可减轻脑缺血再灌注损伤引起的损伤。

脑缺血再灌注损伤机制复杂，其中内源性抗氧化因子减少、氧自由基增加以及随后的氧化应激被认为在缺血再灌注中起着关键作用。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，包括MDA、酮基、羟基等。因此，MDA含量高低可反映脂质过氧化程度。而SOD可通过歧化反应清除体内生成的氧自由基、阻断脂质过氧化连锁反应，保护细胞免受损伤[19]，其活性高低可反映机体清除氧自由基的能力。与缺血再灌注组比较，本研究结果提示，槲皮素能显著提高SOD活性、降低MDA含量，提示槲皮素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制可能与其抗氧化特性有关。

综上所述，槲皮素可改善大鼠局灶性脑缺血再灌注后引起的神经功能损害，减轻脑水肿及脑组织损害程度，提高内源性抗氧化酶活性，降低脂质过氧化反应，从而发挥神经保护作用。

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