桑蓓斯凤仙茎尖脱毒稳定增殖与瓶外生根技术优化

宋嘉玮，刘 辉，张 黎

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

桑蓓斯（Impatiens hybrids cv.sunpatience）凤仙花科、凤仙花属草本花卉，是凤仙杂交新品种，花大色艳，颜色多，株型紧凑，长势旺盛，可爆花成球。耐雨，耐35℃以上高温，生命力强，花瓣厚[1-2]。桑蓓斯凤仙以扦插繁殖为主，由于其生长极易形成花芽，导致插穗采取困难。采用组培技术可以获得高品质的组培苗同时缩短繁殖周期[3]，建立成熟的组培繁育体系可获得生长健壮的组培壮苗。本试验建立了桑蓓斯凤仙组培苗稳定增殖体系，为桑蓓斯凤仙工厂化育苗及其相关研究奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以银川市花木公司种植的桑蓓斯凤仙橘红、粉红2个品种为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1外植体采集部位选择 采取桑蓓斯凤仙橘红、粉红2个品种顶芽与侧芽（取≥1 cm、1～2 cm、2～3 cm、3～4 cm）各50个。在解剖镜下剥离茎尖，比较不同品种、不同部位芽的叶芽率。

1.2.2茎尖剥离大小对成活率的影响 试验以橘红、粉红2个桑蓓斯凤仙品种的茎尖为外植体，设茎尖剥离大小为0.1～0.2 mm、0.2～0.3 mm、0.3～0.4 mm、0.4～0.5 mm共4个处理，每个处理接种15瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。每15 d观察成活率及生长情况，比较茎尖剥离大小与成活率的相关性，确定适宜用微茎尖剥离的大小。

1.2.3桑蓓斯凤仙茎尖脱毒灭菌时间筛选 试验以橘红、粉红2个桑蓓斯凤仙品种的叶芽为材料，选取桑蓓斯凤仙嫩芽2 cm左右，去掉外边叶片后，在自来水下冲洗3～4次，无菌水冲洗1～2次。用滤纸吸干后，在超净工作台上用75%乙醇处理30 s，用无菌水冲洗2～3次后，用0.1%升汞溶液灭菌（8、9、10、11 min），无菌水冲洗5～6次，置于消毒烧杯中备用。无菌操作将茎尖接种于MS培养基上，每个处理接种15瓶，每瓶1个外植体，重复3次。15 d后记录1次外植体的启动率、污染率与死亡率。

1.2.4桑蓓斯凤仙微茎尖培养 试验以橘红、粉红2个桑蓓斯凤仙品种剥离的茎尖生长点为材料，接种在MS+6-BA0.5 mg/L的培养基中，每15 d记录1次生长情况。

1.2.5桑蓓斯凤仙继代增殖及培养基筛选 试验以MS为基本培养基，以无菌苗为试验材料，剪取1 cm左右的带芽茎段，接种于添加不同质量浓度6-BA和NAA的培养基上（表1），共9个处理，培养30 d，统计不定芽增殖情况及生根情况，筛选出适宜的激素质量浓度。

表1 不同激素处理组合设计

1.2.6桑蓓斯凤仙瓶苗扦插生根 将2个桑蓓斯凤仙组培脱毒继代苗洗去根部培养基，剪成1～3 cm带芽的茎段，移栽至草炭基质中，加盖薄膜、无纺布保湿并遮阴，15 d后统计生根存活情况。

1.3 试验数据处理与分析

使用excel 2010和SPSS 19.0对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 桑蓓斯凤仙外植体采集部位、大小与叶芽率的关系

2.1.1桑蓓斯凤仙外植体采集部位 由表2可知，桑蓓斯凤仙外植体采集部位不同，叶芽率也有所不同。橘红色品种与粉红色品种桑蓓斯凤仙顶芽花芽发生率大于叶芽，而侧芽叶芽发生率大于花芽率，品种间无显著差异。

表2 外植体采集部位与叶芽数量的关系

2.1.2桑蓓斯凤仙侧芽大小与叶芽率的关系 由表3可以得出，侧芽的叶芽率与侧芽大小呈负相关；侧芽的花芽率与侧芽大小呈正相关，2个品种桑蓓斯凤仙间差异不显著。在采集时应选取1～2 cm大小侧芽进行茎尖离体培养，0～1 cm侧芽叶芽率虽高于1～2 cm侧芽，但芽体幼嫩操作时易受到损伤。

表3 桑蓓斯侧芽大小与叶芽率

2.2 茎尖剥离大小对成活率的影响

由表4可知，随着剥离的茎尖增大，成活率呈先增长后减弱的趋势，污染率与剥离茎尖大小无关，褐化率随茎尖增大而减小。茎尖剥离过小易发生褐化，0.1～0.2 mm大小的茎尖褐化率达26.7%。0.3～0.4 mm大小的茎尖成活个数最多，成活率达73%，在茎尖剥离大小中效果最好。

表4 桑蓓斯茎尖剥离大小对成活率的影响

2.3 桑蓓斯凤仙茎尖脱毒灭菌时间筛选

由表5可知，存活率随灭菌时间增长呈先上升后下降趋势；褐化率则随时间增长而增加；污染率呈先降低后上升趋势。橘红色品种在灭菌8 min时成活率为53.3%，9 min时达到最高值73.3%，之后随灭菌时间增长而降低；粉红色品种桑蓓斯凤仙在灭菌8 min时成活率达50%，9 min时达80%，之后也随灭菌时间增长而降低。桑蓓斯凤仙外植体灭菌时间最佳为9 min，小于9 min灭菌效果欠佳，而大于9 min随灭菌时间的增长褐化率也有所增长。

表5 桑蓓斯凤仙茎尖脱毒灭菌时间筛选

2.4 桑蓓斯凤仙微茎尖培养及继代增殖培养基筛选

2.4.12个品种桑蓓斯凤仙微茎尖培养比较由图1、图2可知，2个品种桑蓓斯凤仙剥离成活后生长缓慢，45 d后愈伤组织形成，分化出根系。随着根系的生长，株高、叶片数也逐渐增加。45 d后2个品种桑蓓斯凤仙生长加快，其中根系生长尤为明显。橘红色品种生长略大于粉红色品种。

图1 粉红色品种桑蓓斯凤仙微茎尖培养比较

图2 橘红色品种桑蓓斯凤仙微茎尖培养比较

由表6可知，粉红色品种在芽数、株高、节间长、叶片数方面优于橘红色品种，2个品种节数相同；粉红色品种株型略大于橘红色品种。在增殖方面，粉红色增殖芽数大于橘红色，但2个品种增殖系数相同。

表6 2个品种桑蓓斯凤仙继代增殖比较

2.4.22个品种桑蓓斯凤仙继代增殖培养基筛选由表7可知，当6-BA0.5 mg/L、NAA0.1 mg/L时，2个品种桑蓓斯凤仙芽数、株高、节间长优于其他质量浓度达到显著水平。随着6-BA质量浓度增长，三项指标均呈先增长后下降趋势，芽数及株高在6-BA0.5 mg/L时与其他处理存在显著差异，达到最大值；节间长在6-BA0.3 mg/L时达到最大值。因此，6-BA0.5 mg/L对橘红色桑蓓斯凤仙生长促进效果最明显。当NAA质量浓度从0.1 mg/L增加至0.2 mg/L时，对芽数、株高、节间长均有明显抑制作用。

表7 不同处理对2个品种桑蓓斯凤仙继代增殖的影响

2.5 桑蓓斯凤仙组培苗瓶外生根技术优化

桑蓓斯凤仙组培苗瓶外生根成活率及性状比较见表8。取生长健壮的2个品种桑蓓斯凤仙瓶苗各20瓶，橘红色插穗140株、粉红色插穗160株，洗去根部培养基剪成1～3 cm带芽的茎段，移栽至草炭基质中保湿遮阴，15 d后全部存活，生根率达100%，存活率达100%。2个品种间根系数量长度粗细相似，粉红色品种根系略优于橘红色品种。

表8 2个品种桑蓓斯凤仙瓶外生根成活率比较

3 讨论与结论

3.1 讨论

本试验通过桑蓓斯凤仙茎尖离体培养及继代增殖培养，筛选出适合其的茎尖剥离大小及继代增殖最适培养基。刘静等[4]以凤仙的带芽茎段、茎尖、幼叶为外植体培养，结果表明，诱导芽的最适培养基为MS+0.5 mg/LBA+0.01 mg/LIAA+0.01 mg/LGA3，芽的增殖培养基为MS+1.0 mg/LBA+0.01 mg/LIAA+0.01 mg/LGA3；增殖系数为6～8倍。根诱导最佳培养基为MS+0.1～0.5 mg/LBA+0.005 mg/LIAA。赵贞[5]研究表明，以无菌苗的幼嫩叶片作为愈伤组织诱导的外植体，愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/LNAA，其诱导率达100%；凤仙花愈伤组织分化出根的最佳培养基为MS+0.2 mg/LKT+0.05 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA；分化出芽的最佳培养基为MS+0.3 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA。佟凤芹[6]等以凤仙茎段为外植体研究表明，在附加BA1.0 mg/L、NAA0.2 mg/L、3%蔗糖的MS固体培养基上可诱导茎段外植体直接产生大量不定芽，在含BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L、3%蔗糖的MS培养基上进行继代培养，可大量增殖。

3.2 结论

1）桑蓓斯凤仙侧芽的叶芽率大于顶芽，1～2 cm大小的侧芽叶芽率最高；消毒9 min，茎尖剥离0.3～0.4 mm，成活率最高达73%。

2）继代培养最适培养基为MS+6-BA0.5/mg/L+NAA0.1 mg/L，增殖系数达3.6。

3）桑蓓斯凤仙组培苗瓶外生根，生根率达100%。