功能菌株及其复合菌剂发酵配合饲料的研究

■王 飒 郭晓军，2 李 佳，2 宋 卓 王世英，2 朱宝成，2 王 伟，2*

（1.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071000；2.河北省饲用微生物技术创新中心，河北 保定 071000）

微生物发酵饲料是畜牧养殖业常用的饲料，通过添加微生物菌剂，不仅能保留饲料原料本身的营养，还具有很好的抗菌效果，发酵后营养物质增加，也是较好的抗生素替代品。微生物发酵饲料常用微生物菌种包括芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等[1-2]，不同菌种在发酵过程中作用不同。芽孢杆菌抗逆性强，能抑制好氧有害菌生长，促进厌氧有益菌增殖，能耐受胃酸和胆盐，产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种消化酶，降解大分子物质，促进动物营养代谢，芽孢杆菌常用菌种为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌[3-4]。酵母菌富含丰富的蛋白酶，可以通过蛋白酶降解蛋白质提高酸溶蛋白含量，并且可以产生生物活性物质[5-6]。乳酸菌可以通过菌群将蛋白质水解成氨基酸和多肽，增加发酵体系中氨基酸和多肽含量，促进动物消化吸收[7]。

微生物发酵饲料能改善饲料的适口性[8]、促进动物分泌多种消化酶[9]、消除抗营养因子[10]、增加生物活性因子[11]、产生抗菌活性物质[12]、提高营养物质的体外消化率[13]、维护肠道菌群平衡并且提高经济效益[14]。因此，通过微生物发酵饲料，不但具有良好的应用价值，而且在代替抗生素方面有现实意义。

近些年来，对微生物发酵饲料的研究越来越深入。目前，通常采用单菌株或几种互不拮抗的菌种复配成菌剂进行发酵。Shi等[15]采用枯草芽孢杆菌和屎肠球菌发酵玉米-豆粕混合饲料，对照组为同条件下自然发酵，结果表明乳酸菌是发酵过程中的主要优势菌群，其产生大量乳酸从而降低物料pH，试验组大豆抗原蛋白含量显著降低，酸溶蛋白、小肽和游离氨基酸含量提高了6.5倍。史路路等[16]在玉米蛋白粉中添加酵母菌进行优化发酵，发酵后粗蛋白含量提高了20.04%，氨基酸和可溶性小肽也显著增加。Wang等[17]用芽孢杆菌和乳酸杆菌共同发酵构树叶，显著降低了纤维素含量，提高了小肽和必需氨基酸含量，提供了大量营养物质。Hao等[18]采用枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌复合发酵混合物料（20%玉米、20%豆粕、48%麸皮和12%大豆皮），结果发现通过发酵能有效降解复合饲料的抗营养因子，提高饲料酸溶蛋白水平。

本试验室前期已筛选了多株具有产酸、产蛋白酶、纤维素酶和产抗菌物质等功能的菌株，发酵后可明显提高配合饲料的营养结构和品质。试验以单菌株及其复配菌剂分别发酵配合饲料，以pH、酸溶蛋白/粗蛋白、抗原蛋白和抑菌活性为主要检测指标，分析功能单菌株及其复合菌剂的发酵效果，研究菌株对发酵饲料产物营养成分的影响，为丰富发酵菌种提供相应的基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

解淀粉芽孢杆菌FM-18、枯草芽孢杆菌FM-20和酿酒酵母JM-1均由河北农业大学制药工程系实验室分离并保存。

1.2 仪器

样品粉碎机（PW 177），天津泰斯特仪器有限公司；pH计（ST 3100），奥豪斯仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4J），金坛市杰瑞尔有限公司；离心机（TG 20 M），长沙市高新区麓谷国际工业园；分析天平（EN 1480 e=10d），民桥精密科学仪器公司；自动凯氏定氮仪（K 9840），济南海能仪器有限公司；电泳仪（BIO-RAD），美国伯乐仪器有限公司。

1.3 试验方法

试验设置3个单菌株发酵体系和1个复合菌剂发酵体系，均以60%玉米粉、25%豆粕和15%麸皮为原料，设置含水量为40%。单菌株FM-18、FM-20、JM-1 3 种发酵体系均按其菌株活菌数1.0×109CFU/kg（干物质）加入到原料中；3 种单菌株活菌数以FM-18：FM-20：JM-1=1：2：2 为比例配制成复合菌剂，再按1.0×109CFU/kg（干物质）加入到原料中，4 种发酵体系均在37 ℃下发酵14 d。发酵过程中采用五点法每隔2 d取样1次，每个发酵取样点设置3个平行。

1.4 检测指标分析方法

1.4.1 物料pH测定

称取发酵样品10 g（精确至0.001 g）于90 mL 无菌水中，220 r/min 振荡摇匀1 h，采用pH 计测定上清液的pH。

1.4.2 酸溶蛋白含量的测定

取烘干后的样品0.5 g（精确至0.001 g）加入消煮管中，采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白含量。具体测定方法详见GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》。

取新鲜样品3 g（精确至0.001 g），加25 mL 15%三氯乙酸浸提4 h，10 000 r/min 离心5 min，取5 mL上清液于消煮管中，采用凯氏定氮法测定饲料中酸溶蛋白含量。具体测定方法详见NY/T 3801—2020《饲料原料中酸溶蛋白的测定》。

式中：A0——粗蛋白中含有的酸溶蛋白含量（%）；

A1——酸溶蛋白含量（%）；

A2——粗蛋白含量（%）。

1.4.3 SDS-PAGE凝胶电泳法检测抗原蛋白

将发酵饲料研磨，过60 目筛，取100 mg 加2 mL Tris-HCl（pH 8.8），漩涡振荡，10 000 r/min离心5 min，上清液与上样缓冲液按4：1比例混合，沸水浴10 min，10 000 r/min离心5 min，待测。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，备用。

取10 μL待测样品和5 μL Maker分别进行点样，分离胶电压为90 V，浓缩胶电压调为120 V。考马斯亮蓝R 250法染色，并用脱色液（甲醇：水：冰乙酸=9：9：1）洗脱至条带清晰。

1.4.4 抑菌活性

称取40 g（精确至0.001 g）发酵饲料于250 mL三角瓶中，加70 mL 甲醇[19]，混匀浸提2 h 后用4 层纱布过滤，4 ℃保存。在已制备好的大肠杆菌和沙门氏菌病原菌平板上打孔，每孔中加入100 μL浸提液，37 ℃培养24 h，量取抑菌圈直径并记录。

1.4.5 数据处理与统计

试验结果用Excel 2019、SPSS 22.0软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 功能菌株及其复合菌剂发酵过程中pH变化（见图1）

图1 功能菌株及其复合菌剂发酵过程中pH变化

微生物进行固态发酵时，pH 降低的速度和程度可反映发酵过程中乙酸、乳酸等脂肪酸的产生情况。同时，低pH 可以抑制大部分病原菌的增长[20]，因此，pH常作为评价饲料发酵品质的指标之一。功能菌株及其复合菌剂发酵过程中pH变化见图1所示。

由图1 可知，随着发酵时间的增加，各发酵体系pH总体都呈下降趋势。当发酵到第2天时，FM-20菌株发酵体系中pH 下降至4.37，说明FM-20 菌株发酵中产生了多种酸性物质；下降幅度从大到小依次为：FM-20>复合菌剂>JM-1>FM-18，下降幅度差异显著（P<0.05）。当发酵第14 天时，不同发酵体系的pH 差异不显著（P>0.05）。

2.2 功能菌株及其复合菌剂发酵过程中酸溶蛋白含量变化（见图2）

粗蛋白含量是评价饲料质量的一个重要指标，反映了饲料中蛋白质营养水平。酸溶蛋白包括肽和游离氨基酸，饲料经过发酵后大分子蛋白质被降解为容易被吸收的氨基酸和小肽，因此酸溶蛋白在一定程度上反映了小肽含量[21]。各功能菌株及其复合菌剂发酵过程中酸溶蛋白含量变化见图2所示。

由图2可看出，随着发酵时间的增加，酸溶蛋白含量都呈先快速上升后趋于平稳的趋势，但在发酵过程中含量有差异。4种发酵体系中复合菌剂体系酸溶蛋白含量最高能达到35.98%，单菌株发酵体系相对较低。发酵前期（0-6 d），复合菌剂发酵体系酸溶蛋白含量低于单菌株体系，与单菌株相比差异显著（P<0.05），发酵后期（8-14 d），菌株间进行协同提高了复合菌剂发酵体系酸溶蛋白含量，发酵第14天时与单菌株相比差异不显著（P>0.05）。

图2 功能菌株及其复合菌剂发酵过程中酸溶蛋白含量变化

2.3 SDS-PAGE 凝胶电泳检测不同发酵体系的饲料蛋白质的分子量（见图3）

饲料中豆粕作为主要的蛋白质来源，其蛋白质结构复杂，含有的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，具有抗营养作用，影响动物的消化吸收[22]。通过检测原料和4种发酵体系发酵14 d后的产物，探究发酵饲料中大分子蛋白的降解情况。不同发酵体系蛋白的SDSPAGE检测结果如图3所示。

图3 不同处理饲料的SDS-PAGE图

饲料中含有的大分子蛋白难于消化，尤其是β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白免疫原性强，是引起幼龄动物出现过敏反应的主要因素。β-伴大豆球蛋白包括3 个亚基，分别是α亚基（分子质量76 ku）、α'亚基（分子质量72 ku）和β亚基（分子质量52～54 ku）；大豆球蛋白包括两个亚基，分别是酸性亚基A（分子质量35 ku）和碱性亚基B（分子质量20 ku）[21]。由图3可看出，经过微生物发酵后，大分子抗原蛋白有着不同程度的降解，尤其是复合菌剂发酵后，α亚基和α'亚基条带完全消失，β亚基、A 亚基颜色变浅，分子量较低的蛋白条带加深。

2.4 功能菌株及其复合菌剂发酵产物对致病菌的抑制效果（见图4～图6）

图4 功能菌株及其复合菌剂发酵产物对大肠杆菌的抑制效果

图5 功能菌株及其复合菌剂发酵产物对沙门氏菌的抑制效果

图6 功能菌株及其复合菌剂发酵产物对致病菌的抑制效果

大肠杆菌和沙门氏菌是引起肠道疾病的常见致病菌，饲料经微生物发酵后产生代谢物质对致病菌有一定的抑制作用，可以提高饲料的发酵效果[23]。不同发酵时间复合菌剂和单菌发酵产物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制活性见图4～图6。

由图4 和图5 可知，发酵开始时浸提物均对致病菌无抑制活性。发酵后，各发酵产物的浸提液均具有对致病菌的抑制作用。由图4可看出，与单菌株发酵相比，复合菌剂发酵产物对大肠杆菌的抑制效果显著（P<0.05），发酵到第14天时复合菌剂发酵配合饲料抑制大肠杆菌活性为1.18 cm2。由图5 可知，FM-20 菌株产生抑制沙门氏菌的抗菌物质能力较强，在发酵后期（8-14 d）对沙门氏菌抑制效果显著（P<0.05），但发酵终点时与复合菌剂发酵产物抑制效果无显著差别（P>0.05），与JM-1菌株相比，发酵后期（8-14 d）抑制效果显著（P<0.05）。由图6 可以明显看出，发酵0 天时4 种体系的发酵产物对大肠杆菌和沙门氏菌均无抑菌圈，发酵第14 天时4 种发酵体系的发酵产物对两种致病菌均有明显的抑菌圈。从以上试验结果可得出，饲料经微生物发酵后产生的代谢物质对致病菌有抑制作用，且3 种功能菌株产生协同作用具有更好的抑菌效果。

3 讨论

物料pH的下降和发酵体系中氧气的消耗会为乳酸菌的生长和厌氧反应提供基础，低pH 有利于乳酸菌的生长。田晓玲等[24]指出发酵过程乳酸菌会产生大量消化酶，将饲料里的大分子蛋白降解成氨基酸和多肽，改善动物的消化吸收，提高饲料的利用率。舒刚等[25]饲喂青脚麻鸡发酵玉米豆粕日粮，发现肠道中pH 逐渐降低，鸡肠道中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量显著降低，乳酸菌数量显著增加。

本试验中通过发酵产物pH的变化可以看出单菌株FM-20的产酸能力较强，相较于另两种单菌株产酸性效果显著，JM-1菌株产酸能力较弱，复合菌剂发酵体系pH 介于FM-20 和JM-1 之间。由此说明3 种菌共同发酵时，FM-20菌株主要发挥了降低pH的作用，但是否因为复合发酵使FM-20 菌株的生长繁殖受到了抑制，而使复合菌剂发酵pH 降低速度小于FM-20菌株发酵还需进一步验证。复合菌剂发酵产物对大肠杆菌的抑制作用比单菌株强，并且对沙门氏菌也有较强的抑制作用。因此，3种益生菌复合协同发酵后微生物产生大量抗菌物质抑制致病菌，提高饲料了发酵质量。

配合饲料中豆粕成分提供了所需的蛋白质含量，氨基酸组成均衡，其抗原蛋白可以通过芽孢杆菌的产酶系统降解。芽孢杆菌利用多种营养物质，并且分泌多种蛋白酶，这些蛋白酶水解大分子蛋白成有利于动物消化吸收的物质，并且微生物发酵饲料不仅能降解饲料中结构复杂的大分子蛋白，还能提高粗蛋白和酸溶蛋白的含量，提高蛋白质的利用率[26]。

试验中通过酸溶蛋白含量和SDS-PAGE 检测蛋白凝胶电泳结果可以明显看出，在发酵后期各菌株的协同作用提高了复合菌剂发酵饲料质量。以酸溶蛋白含量来分析，发酵前期单菌株发酵含量高于复合菌剂，但发酵后期复合菌剂发酵产物酸溶蛋白含量明显升高，均高于单菌株发酵产物。另外，从SDS-PAGE凝胶图可以看出，与单菌株产物相比，复合菌剂发酵后大分子蛋白降解效果明显，小分子量多肽增加明显，为微生物发酵饲料后抗原蛋白的降解提供了有力说明，这与许多学者研究结果一致。杨骏等[27]用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌为菌种发酵果蔬饲料，以生物量为指标，试验结果表明，复合菌剂发酵比单菌发酵粗蛋白含量提高了61.88 g/L，饲料的营养价值得到提高。汤小朋[28]以木薯渣为原料，黑曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母为菌种，研究单菌和复合菌剂发酵木薯渣的营养品质，试验结果表明复合菌剂发酵效果更好，单菌发酵后粗蛋白含量提高了4.81%，复合菌剂发酵粗蛋白含量提高了7.15%。黄晓霞[29]以柚皮为原料，以啤酒酵母和黑曲霉为菌种进行单菌和复合菌剂发酵生产蛋白饲料，试验结果发现复合菌剂发酵比单菌发酵效果好，粗蛋白含量提高到28.78%，是原料的6～7 倍，且发酵后饲料适口性好。但也有学者得出不同结论，谭显东等[30]以康宁木霉菌和热带假丝酵母为菌种发酵三七渣生产蛋白饲料，试验结果得出发酵中后期单菌发酵体系的真蛋白含量更高。

4 结论

本试验主要研究了复合菌剂和各功能菌株对固态发酵鸡配合饲料质量的影响，通过测定不同时间发酵产物的物料pH、酸溶蛋白含量、对致病菌的抑制效果和SDS-PAGE 凝胶电泳法检测抗原蛋白降解的程度来评价饲料质量。试验结果表明，不同功能菌株具有不同的发酵效果，经过复配之后，在多个指标方面具有明显优势，尤其是物料pH、大肠杆菌的抑制活性、酸溶蛋白含量和抗原蛋白的降解方面具有协同效应。

微生物发酵饲料已成为畜牧生产中不可缺少的一部分，它既解决了资源浪费问题，还具有环保、绿色、健康等特点，是未来饲料行业的重点。本研究对于丰富发酵微生物菌种及扩大其应用、提高饲料品质具有重要的作用，为微生物发酵饲料提供了新思路。