碳酸酐酶Ⅸ蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其与预后的关系

吴芸，张贵

鼻咽癌在我国具有较高发病率，放化疗是针对中晚期鼻炎癌治疗的主要方法，但术后仍具有较多病人存在转移和复发的可能性，相关研究提示放化疗联合靶向药物治疗能够有助于提高病人的生存率并改善生活质量［1］。文献提示实体肿瘤普遍存在乏氧，进而诱发生成肿瘤血管，促进肿瘤的发生、发展、转移及浸润［2］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）被证实与肿瘤乏氧细胞关系密切，而乏氧能够抗拒放疗，CAⅨ可在多种恶性肿瘤中过度表达，进而影响肿瘤的进展和病人的预后［3］。文献提示酶联免疫法检测鼻咽癌CAⅨ表达水平，发现其与肿瘤的预后具有相关性［4］，但鼻咽癌组织中的CAⅨ水平与肿瘤进展情况是否具有一致性还有待进一步研究证实。故而，本研究利用免疫组化染色法检测CAⅨ蛋白表达并探讨了其在鼻咽癌组织中的表达及与预后的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013 年1 月至2015 年1 月泰州市人民医院保存的鼻炎癌组织标本122 例，男77例，女45 例，≤45 岁56 例，＞45 岁66 例。纳入标准：（1）均经病理学确诊；（2）术前未行放化疗等抗肿瘤治疗；（3）临床随访资料保存完整。排除标准：（1）合并有其他系统肿瘤；（2）合并有心脑血管疾病、肝肾功能障碍、免疫系统疾病等；（3）妊娠期或哺乳期妇女。同时选取慢性鼻咽炎性组织60 例作为对照组，其中男40例，女20例，≤45岁25例，＞45岁35例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组病人或其近亲属对所受检测知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 检测方法采用免疫组化染色法检测CAⅨ蛋白表达，取适量鼻咽癌肿瘤组织，常规石蜡切片，脱蜡、水化后利用柠檬酸高压修复抗原过氧化氢（3%）阻断内源化过氧化物酶活性，鼠抗人CAⅨ一抗加入后反应过夜（4 ℃），二抗30 min孵育（37 ℃），DAB显色，苏木精复染，PBS代替一抗为阴性对照并设立阳性对照［5］。

1.3 结果判断以细胞膜或胞质出现黄色颗粒为阳性染色。（1）染色强度：无着色为0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。（2）阳性细胞比例：＜10%为0 分，10%～＜25%为1 分，25%～＜50%为2 分，≥50%为3 分。（1）+（2）得分≥3 分为阳性表达［6］。

1.4 统计学方法使用SPSS 22.0 进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，均通过正态性检验，以±s描述。两组间的比较为成组t检验或校正t检验。计数资料以例数及率描述，采用χ2检验或校正χ2检验。 此外，生存等时间队列资料建立Kaplan-Meier 乘积限生存曲线模型，组间生存率比较为Logrank 检验。预后（无进展生存）影响因素的综合分析为COX 比例风险回归，采用逐步后退法进行变量的选择和剔除。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组CAⅨ蛋白表达比较鼻咽癌组CAⅨ蛋白阳性68 例，表达率为55.74%，明显高于慢性鼻咽炎性组的10（16.67%）例，差异有统计学意义（χ2=25.07，P＜0.05）。

2.2 CA Ⅸ蛋白表达与病人临床病理特征关系CAⅨ蛋白表达和淋巴结转移有密切关联（P＜0.05），与病人年龄、性别、肿瘤长径、TNM 分期、病理类型和淋巴结转移无显著关联（P＞0.05）。但TNM 分期的P值较小（P=0.056）见表1。

表1 碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ）蛋白表达与病人临床病理特征关系/例（%）

2.3 CAⅨ蛋白表达与无进展生存资料关系术后所有病人均常规给予同步放化疗。CAⅨ蛋白阳性表达组无进展中位生存期为46个月（95%CI：36.7～55.2），明显低于CAⅨ蛋白阴性表达组的60 个月（95%CI：48.3～72.9），经Logrank 检验差异有统计学意义（χ2=5.41，P=0.020），见图1。

图1 鼻咽癌组生存曲线图

2.4 鼻咽癌病人预后（无进展生存）影响因素的COX 回归分析建立COX 比例风险回归模型，以本研究资料为样本，以预后状况（无进展生存）为应变量，赋值1=有进展或死亡，0=无进展，t=无进展生存期。以CAⅨ蛋白表达及前述单因素分析（表1）中P＜0.10 的指标/因素为自变量。各变量赋值见表2。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。 回归结果显示：TNM 分期（较高）、淋巴结转移和CAⅨ蛋白阳性表达是鼻咽癌病人预后（无进展生存）的危险影响因素（HR=2.06、1.65和1.47，P＜0.05）。

表2 鼻咽癌病人预后（无进展生存）影响因素的COX回归分析结果

3 讨论

鼻咽癌致病因素较多，大部分病人确认时已为晚期，因此，能够在早期进行准确诊断或抑制肿瘤细胞的转移对提高治疗效果和延长病人生存期具有重要临床意义［7］。血清标志物的检测是肿瘤诊断的重要方法之一，因灵敏性高、操作简单方便等优点在临床应用广泛。碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶及肿瘤坏死因子均是重要的鼻咽癌血清标志物，但上述多种标志物仅能对鼻咽癌的某一特性进行反映，无法反映鼻咽癌的总体情况［8-9］。

CAⅨ是一类肿瘤相关抗原，亦是碳酸酐酶家族的重要成员，文献提示CAⅨ与表皮生长因子受体等肿瘤特异性转移和侵袭性蛋白表达呈正相关［10］。本研究比较鼻咽癌组和慢性鼻咽炎性组CAⅨ蛋白表达发现鼻咽癌组CAⅨ蛋白阳性表达率明显高于慢性鼻咽炎性组；临床病理关系结果显示CAⅨ蛋白表达与病人年龄、性别、肿瘤长径、TNM 分期、病理类型无明显关联关系。上述结果提示CAⅨ蛋白的编导可能与鼻咽癌的病情程度具有相关性。文献［11-12］提示β-catenin 能与CAⅨ相互作用进而降低细胞黏附作用，而细胞黏附作用的不稳定及丧失与肿瘤的侵袭性关系密切，因此CAⅨ可能是通过介导细胞的黏附作用而促进肿瘤的进展、转移和复发。

CAⅨ蛋白表达与无进展生存期关系结果显示CAⅨ蛋白阳性表达组无进展生存期为46 个月明显低于CAⅨ蛋白阴性表达组的60 个月。上述结果提示鼻咽癌组织CAⅨ蛋白表达异常升高可导致鼻咽癌病人的预后恶化。有研究对头颈鳞癌病人的CAⅨ表达分析发现，阳性表达病人存在较大的肿瘤坏死范围，微血管密度和T 分期也有升高或增强现象［13］，进而提示CAⅨ的过表达有利于肿瘤细胞的生存，能够在某种程度上提高肿瘤细胞抗拒放化疗的能力，具有成为头颈肿瘤治疗重要靶点的潜力。相关研究将星形细胞瘤进行检测发现，近80%的细胞瘤存在CAⅨ阳性表达，该表达水平还与肿瘤分级存在关联性［14-15］，提示CAⅨ具有成为细胞瘤预后的重要预测因子。

COX 回归分析研究中将上述病人临床病理特征、CAⅨ蛋白表达作为自变量，无进展生存期作为因变量进行COX 回归分析，结果显示，TNM 分期、淋巴结转移和CAⅨ蛋白表达是鼻咽癌病人预后（无进展生存）的危险影响因素。上述结果提示鼻咽癌组织CAⅨ蛋白表达是病人预后和病情发展的重要因素。研究证实HIF-1α 能够促进上皮-间质的转移和转化，进而调节肿瘤重要的介质TEIST 的表达而加速肿瘤的转移，而CAⅨ作为HIF-1α 下游的重要靶基因，其与HIF-1α 的表达呈显著正相关，因而CAⅨ促进鼻咽癌肿瘤细胞的转移可能是通过介导HIF-1α 的表达，进而调节鼻咽癌肿瘤敏感转移介质的表达而影响病人的预后［16-18］。因此，临床可考虑CAⅨ为研究靶点对鼻咽癌的具体作用机制进行大样本量的深入分析以确证CAⅨ的具体作用机制，进而为临床鼻咽癌的早期诊断和预后提供新的思路。