血清长链非编码RNA-尿路上皮癌相关分子1对甲状腺乳头状癌的鉴别诊断价值

王新征，侯永强，汲权威

甲状腺结节是一种常见的甲状腺病，甲状腺上的结节可能是结节性甲状腺肿、甲状腺瘤、甲状腺癌等病因，未明确性质前统称为甲状腺结节［1］。因术前甲状腺结节确诊较为困难，造成国内外对甲状腺结节存在普遍过度治疗［2］。早期发现甲状腺肿瘤并进行良恶性区分，对临床后期治疗和预后评估有至关重要的作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类长度大于200 核苷酸的非编码RNA的总称，LncRNA虽不编码蛋白质，但可通过调控基因表达在肿瘤发生、发展中发挥重要作用［3］。研究表明，LncRNA-尿路上皮癌相关分子1（lncRNA urothelial carcinoma associated 1，LncRNA UCA1）在胃癌、前列腺癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中高表达，并发挥致癌基因的作用［4-5］，然而关于LncRNA UCA1 在甲状腺结节性质鉴别诊断中的研究较少。本研究通过检测甲状腺结节病人术前血清LncRNA UCA1 水平，初步探讨LncRNA UCA1 水平对甲状腺结节良恶性的鉴别诊断价值，以期为甲状腺癌的早期干预和预后评估提供重要依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018 年1 月至2020 年1 月于河南科技大学第一附属医院住院治疗的甲状腺乳头状癌病人48 例（甲状腺乳头状癌组）和甲状腺良性结节病人32例（良性结节组）为研究对象（均为术后病理确诊），两组病人均无临床症状，由病人偶尔或体检时发现。同期选取甲状腺功能正常的49 例健康体检人群为健康对照组。三组性别、年龄、单发或多发、结节大小比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 甲状腺乳头状癌、甲状腺良性结节及健康对照一般资料结果比较

纳入标准：①病人符合甲状腺乳头状癌及甲状腺良性结节诊断标准［6］，并经超声、病理活检确诊；②病历资料完整者；③既往无颈部手术史；④既往无恶性肿瘤史，且未接受放化疗者。排除标准：①患有慢性炎症性疾病、急性感染性疾病者；②伴有肝炎、肾病、糖尿病、结核病等其他内科疾病者；③精神异常者；④严重的肝肾功能不全者；⑤妊娠或哺乳期妇女。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准（伦理批号20171209），所有受试对象均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，同时签署手术知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒，购自北京天漠科技开发有限公司；反转录试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司；miScript SYBR® Green Mix，购自上海齐一生物科技有限公司。qRT-PCR仪（型号7500），购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存抽取健康体检者体检时及两组病人术前清晨空腹静脉血样5 mL，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中LncRNA UCA1 水平采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测三组受试者血清中LncRNA UCA1表达水平。采用RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRTPCR仪对LncRNA UCA1及其内参GAPDH基因进行扩增。qRT-PCR 反应体系共20 µL：cDNA（50 ng/µL）2 µL，miScript SYBR®Green Mix 10 µL，上下游引物（10 µM）各0.8 µL，ddH2O 6.4 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。LncRNA UCA1 及内参GAPDH 基因的引物序列见表2，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。每份样品均设3个重复孔，采用2-ΔΔCt法计算血清中LncRNA UCA1 相对表达量。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法利用SPSS 23.0 对数据进行统计学分析，计量资料符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例（%）表示，组间比较行χ2检验；采用受试者工作特性曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）分析血清中LncRNA UCA1 水平对甲状腺结节良恶性的鉴别诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照组、良性结节组及甲状腺乳头状癌组血清LncRNA UCA1 水平比较甲状腺乳头状癌组LncRNA UCA1 水平高于健康对照组和良性结节组，良性结节组LncRNA UCA1 水平高于健康对照组，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 健康对照组、良性结节组及甲状腺乳头状癌组血清LncRNA UCA1水平比较/±s

表3 健康对照组、良性结节组及甲状腺乳头状癌组血清LncRNA UCA1水平比较/±s

注：①与健康对照组比较，P＜0.05。②与良性结节组比较，P＜0.05。

组别健康对照组良性结节组甲状腺乳头状癌组F值P值例数49 32 48 LncRNA UCA1 1.00±0.24 1.48±0.30①2.13±0.49①②116.40 0.000

2.2 血清LncRNA UCA1 水平对甲状腺结节良恶性的鉴别诊断价值以血清LncRNA UCA1 水平为检验变量绘制ROC 曲线，结果显示，血清LncRNA UCA1 水平诊断甲状腺良性结节的曲线下面积（AUC）为0.899（95%CI：0.835～0.963），截断值为1.194，特异度为81.6%，灵敏度为81.3%；血清LncRNA UCA1 水平诊断甲状腺乳头状癌的AUC 为0.891（95%CI：0.817～0.966），截断值为1.837，特异度为96.9%，灵敏度为77.1%。见图1，2。

图1 血清LncRNA UCA1水平对甲状腺良性结节诊断的ROC曲线

2.3 LncRNA UCA1 表达水平与甲状腺乳头状癌病人临床病理特征的关系根据甲状腺乳头状癌病人血清LncRNA UCA1水平平均值（2.13），24例高于平均值病人为LncRNA UCA1 高表达组，24 例低于平均值病人为LncRNA UCA1 低表达组。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。LncRNA UCA1 高表达组多发病灶、肿瘤大小＞10 mm、有淋巴结转移、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期的病人比例高于LncRNA UCA1 低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

图2 血清LncRNA UCA1水平对甲状腺癌诊断的ROC曲线

表4 LncRNA UCA1表达水平与甲状腺乳头状癌病人临床病理特征的关系/例（%）

3 讨论

甲状腺结节属于内分泌系统最为常见的疾病，在不同的地区其发病率有较大差别［7］。但临床上甲状腺腺瘤或结节性甲状腺肿与甲状腺癌有时不易鉴别，造成甲状腺癌临床确诊困难，存在较高的误诊和漏诊情况，以至于导致病人治疗不及时、预后较差、平均存活时间较短等情况发生［9］。因此，临床上急需有效的高特异度、灵敏度的生物标志物，用于早期鉴别诊断甲状腺结节良恶性，改善预后。

LncRNA 是由RNA 聚合酶Ⅱ对其进行转录、聚腺苷酸化和剪接而成的RNA，LncRNA 的表达与肿瘤的进展、转移、预后均存在非常重要的关联，是肿瘤预防、治疗、预后的突破口［10-11］。LncRNA 可通过调节基因表达、影响蛋白在细胞中的定位等多种方式在肿瘤的发生、发展中发挥作用［12］。LncRNA UCA1 提取自人膀胱移行癌细胞株，广泛参与多种肿瘤的发生、发展。宋小青等［13］研究表明，LncRNA UCA1 的异常高表达与肿瘤大小、分期、淋巴结转移等临床病理特征及病人预后密切相关。本研究结果中，甲状腺乳头状癌组LncRNA UCA1水平高于健康对照组和良性结节组，与Liu 等［14］研究结果中LncRNA UCA1 的表达趋势一致。提示LncRNA UCA1的高表达可能与甲状腺结节由良性发展为恶性有重要联系，推测其可能机制为：LncRNA UCA1 作为内源竞争性RNA，其高表达可负性调节下游与甲状腺癌相关的miRNA 的表达水平，消除miRNA 对靶标转录物的内源性抑制作用，从而促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而加重病人病情，使病人由甲状腺良性结节发展为甲状腺乳头状癌。本研究结果中，血清LncRNA UCA1水平诊断甲状腺良性结节及甲状腺乳头状癌的AUC 分别为0.899、0.891，截断值分别为1.194、1.837，特异度分别为81.6%、96.9%，灵敏度分别为81.3%、77.1%。提示血清LncRNA UCA1 的表达水平可对甲状腺结节的良恶性有一定的鉴别诊断价值，且其诊断特异性较高，当LncRNA UCA1 水平大于1.194 且小于时1.837，甲状腺结节病人为良性的可能性更高，当LncRNA UCA1水平大于1.837 时，甲状腺结节为甲状腺癌的概率更大，对临床诊断有一定的参考作用。此外，本研究中LncRNA UCA1高表达病人多发病灶、肿瘤大小＞10 mm、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的病人比例高于LncRNA UCA1 低表达病人。进一步提示LncRNA UCA1的高表达与甲状腺乳头状癌的发生、发展有密切联系，临床中密切监测LncRNA UCA1水平变化，可能对甲状腺乳头状癌临床后期治疗和预后评估有重要意义。

综上所述，血清LncRNA UCA1在甲状腺乳头状癌病人血清中呈高表达，且对鉴别诊断甲状腺结节的良恶性有一定的价值，同时与甲状腺癌的临床病理特征有一定的相关性。本研究为鉴别诊断甲状腺结节的良恶性提供了新的思路和方向，同时为甲状腺癌的早期干预及治疗提供了一定的理论依据。但作为回顾性研究，本研究样本数量有限，且样本受区域限制，因此后续将扩大样本量，进一步深入研究其具体作用机制及临床应用价值。