内皮细胞特异性分子1和血管内皮细胞生长因子在宫颈鳞癌中的表达及其与上皮-间质转化的相关性

冯磊，杨建敏，杨然，孙丽，董莉丽，张清伟

宫颈癌是全球女性常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率位列女性恶性肿瘤中第二位，主要分为鳞状细胞癌和腺癌［1］。近年随着我国医疗技术水平有的提高，早期行手术或者放疗，宫颈癌的治疗效果得到明显改善，但女性宫颈癌发病病人却逐渐年轻化，发病率也呈增高趋势［2-3］。阻断肿瘤的发生、发展、转移以及血管的生成等在其治疗过程中起着重要的作用，当前宫颈癌治疗所面临的最大难题是肿瘤细胞的侵袭和转移，其中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在发挥着重要作用［4］。内皮细胞特异性分子1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1）是一种新型内皮细胞特异性分子，具有调节血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的功能，研究表明其与肿瘤的发生发展过程中转移、浸润与肿瘤新生血管密切相关［5-6］。故而，探索ESM-1、VEGF 与宫颈鳞癌发生EMT 的关系，为宫颈癌靶向治疗提供新的指导与靶点，有助于治疗方案的制定和预后判定。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018 年12 月至2019 年12 月在南阳市中心医院接受宫颈癌根治术的宫颈鳞癌病人180 例作为研究组，年龄（41.3±5.7）岁，范围为24～63 岁。术后石蜡组织标本，所有宫颈鳞癌病例均经过病理科两名医师阅片后共同诊断。根据宫颈癌FIGO 分期标准进标准分期［7］，其中Ⅰa 期94例，IIa 期86 例；病理组织学分化：低分化61 例，中分化86 例，高分化33 例；肌层浸润＜1/2 宫颈83 例，肌层浸润≥1/2 宫颈97 例；行磁共振成像（MRI）检查示无淋巴结转移130例，有淋巴结转移50例。

另外收集同期南阳市中心医院源于子宫肌瘤切除术的正常宫颈组织石蜡组织标本60 例作为正常组，临床资料完整，年龄（42.5±6.1）岁，范围为21～65 岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究参与者均签署知情同意书。

研究组纳入标准：（1）术前均未进行化疗、放疗或其他辅助治疗；（2）切片均HE 染色，经至少两位病理医师独立诊断为子宫颈鳞癌；（3）不伴有其他恶性肿瘤病史；（4）临床资料完整。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 主要试剂兔抗人E-Cadherin（31955）和Vimentin（5741S）克隆抗体均由美国CST公司提供；兔抗人ESM-1（ATA28878）和VEGF 克隆抗体由武汉益普生物科技有限公司公司提供；兔抗人VEGF（AF0011）克隆抗体由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；SP 免疫组化试剂盒（IH0975R）由上海雅吉生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本免疫组化检测所有宫颈组织经甲醛固定后包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。石蜡切片厚度为5µm，高温烘烤脱水，3%过氧化氢处理后磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，高压法热修复，PBS冲洗，山羊血清封闭，加入一抗ESM-1 抗体（1∶100）、VEGF 抗体（1∶100）、E-Cadherin 抗体（1∶100），Vimentin 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBS 洗脱，加入二抗37 ℃孵育，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，透明处理，中性树胶封片，以PBS代替一抗作为阴性对照，进行镜检判定结果。ESM-1 主要表达于细胞质中，呈棕黄色；VEGF 主要表达于细胞质和细胞膜，呈棕黄色；E-Cadherin 则主要表达于胞膜及胞质中，呈棕黄色或棕褐色；Vimentin 主要表达于细胞质中，呈棕黄色。

1.3.2 结果判定［8］每张切片随机选取3 个有代表性的高倍视野，ESM-1、VEGF、E-Cadherin 评分采用染色强度及阳性细胞数百分比综合评价，Vimentin评分采用染色强度直接评分。染色强度评分：无染色为0分，轻度黄染为1分，中度黄染为2分，重度黄染为3 分。阳性细胞数百分比：计数每个组织的3个10×10 倍视野下肿瘤细胞的阳性细胞数，阳性细胞数百分比=（阳性表达的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数）×100%；评分：＜10%为0 分，10%～24%为1分，25%～49%为2 分，50%～74%为3 分，75%～100%为4 分。ESM-1 结果判定：两者分值的乘积为最终结果，评分0～3 分为阴性，4～12 分为阳性。VEGF 结果判定：两者分值的和为最终结果，评分0 分为阴性，1～7 分为阳性。E-Cadherin 结果判定：两者分值的乘积为最终结果，评分0～4 分为阴性，6～12 分为阳性。Vimentin 结果判定：染色强度直接评分为最终结果，评分0～1 分为阴性，2～3 分为阳性。每张切片的结果判断均由两名高年资病理科医生核准。

1.3.3 比较分析比较正常宫颈和宫颈鳞癌组织中ESM-1、VEGF、E-Cadherin和Vimentin的阳性表达情况。比较其在宫颈鳞癌临床病理特征的阳性表达情况，宫颈鳞癌临床病理特征：根据宫颈癌FIGO分期标准进标准分期分为Ⅰa 期和Ⅱa 期；病理组织学分化程度分为低分化，中分化，高分化；宫颈鳞状细胞癌宫颈浸润深度分为肌层浸润＜1/2 宫颈，肌层浸润≥1/2 宫颈；行MRI 检查示分为有无淋巴结转移。并通过Kendall's tau-b 分析ESM-1、VEGF 与EMT相关蛋白E-Cadherin、Vimentin的相关性。

1.4 统计学方法数据均用SPSS 22.0 进行统计分析，采用χ2检验分析各组间差异，Kendall's tau-b 分析ESM-1 和VEGF 与EMT 的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常宫颈和宫颈鳞癌组织中ESM-1 和VEGF的阳性表达情况免疫组化结果显示，ESM-1、VEGF、Vimentin 在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；E-Cadherin 在宫颈鳞癌组织中的表达显著低于正常宫颈组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 正常宫颈和宫颈鳞癌组织中ESM-1和VEGF的阳性表达率/例（%）

2.2 ESM-1 和VEGF 阳性率与宫颈鳞癌临床病理特征的关系随着宫颈鳞状细胞癌FIGO 分期越高，ESM-1和Vimentin 阳性表达率越高，差异有统计学意义（χ2=17.24，14.72，P＜0.05），对VEGF 和ECadherin 阳性率的影响差异无统计学意义（χ2=0.05，0.91，P＞0.05）；随着宫颈鳞状细胞癌分化程度越高，E-Cadherin 和Vimentin 阳性表达率越高，差异有统计学意义（χ2=29.45，23.31，P＜0.05），对ESM-1 和VEGF 阳性率的影响差异无统计学意义（χ2=2.26，0.68，P＞0.05）；伴有淋巴结转移病人的ESM-1、VEGF 及Vimentin 阳性率高于不伴有淋巴结转移者，E-Cadherin 阳性率低于不伴有淋巴结转移者，差异有统计学意义（χ2=4.03，11.65，24.38，31.57，P＜0.05）；随着宫颈鳞状细胞癌宫颈浸润深度的增加，ESM-1 和VEGF 阳性表达率升高，差异有统计学意义（χ2=6.87，12.92，P＜0.05），对E-Cadherin 和Vimentin 阳性率的影响差异无统计学意义（χ2=1.58，1.53，P＞0.05）。见表2。

表2 ESM-1和VEGF阳性率与宫颈鳞癌临床病理特征的关系/例（%）

2.3 宫颈组织中ESM-1 和VEGF 表达与EMT 的关系宫颈组织中，ESM-1 和VEGF 的表达与ECadherin 呈负相关，Spearman 列联系数为（r=-0.46，-0.306，P＜0.05）；ESM-1和VEGF 的表达与Vimentin 的表达呈正相关，Spearman 列联系数为（r=0.43，-0.36，P＜0.05）。结果提示，宫颈癌组织中异常高表达的ESM-1 和VEGF 可能参与了宫颈鳞癌的EMT过程。见表3。

表3 宫颈组织中ESM-1和VEGF与E-Cadherin、Vimentin表达的相关性分析

3 讨论

子宫颈癌作为女性生殖系统第一大常见的恶性肿瘤，严重威胁病人的健康，其中子宫颈鳞癌占90%以上［9］。其发病机制目前尚不清楚，研究显示其主要因素包括［10］：（1）长期细菌或者人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirs，HR-HPV）和疱疹病毒感染；（2）早婚、早育、多次妊娠等；（3）性行为过多过早；（4）宫颈长期慢性炎症、持续的宫颈糜烂等；（5）长期口服避孕药等。其中，HR-HPV 的慢性、持续性的感染是导致宫颈癌发生的重要诱因。随着医学进步，通过HPV 疫苗的接种及HPV 的筛查，宫颈癌的发病率尽管有所下降，但仍有大量女性因患宫颈癌而死亡［11］。人正常宫颈感染HR-HPV 后，宫颈上皮组织中的β-连环素表达降低，上皮细胞标记相关蛋白E-Cadherin 的表达下降，而间质细胞相关蛋白Vimentina 表达升高，细胞呈纺锤形发生EMT［12］，细胞侵袭、迁移能力增强。而侵袭、转移是宫颈癌导致病人死亡的主要原因。

近期的肿瘤研究表明，EMT 与肿瘤原位浸润及远处转移过程密切相关，在多种上皮性恶性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤进展过程的研究均发现EMT 现象，其促进肿瘤的侵袭、转移、耐药等，且病人预后较差［13-14］。据此，学者提出以针对EMT 来减少肿瘤的侵袭、转移及复发进行治疗［15-16］。EMT 是上皮细胞在某些因素的作用下，细胞的极性及细胞间黏附能力减弱、骨架重组，转化为具有间质表型细胞，其迁移和运动能力增加。其主要特征包括：上皮性细胞标记分子E-Cadherin、α-连环素、β-连环素及紧密连接蛋白等表达下降，间质性细胞标记分子Vimentin、N-钙黏蛋白及α-平滑肌肌动蛋白等表达升高；细胞间的相互作用丢失；细胞角蛋白细胞结构改变骨架转化为Vimentin，演变为纺锤形纤维细胞形态，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得间质细胞的表型。E-Cadherin 是构成上皮细胞间黏附的重要成分，Vimentin 是一种中间丝蛋白，主要表达于间叶组织细胞中，异常表达会使细胞骨架蛋白构成改变［17-18］。提示，宫颈鳞癌组织中EMT 的发生是通过抑制E-Cadherin，β-连环素的表达以及促进Vinnetin 的表达实现的，及E-Cadherin的降低及Vimentin 表达的升高成为EMT 程序启动的主要分子标识［19］。本研究发现，宫颈鳞癌上皮黏附蛋白标志物E-Cadherin 表达下降，间质标志物分子Vimentin 表达上调，提示发生EMT，与既往研究结果一致［20］。

又有研究表明，在肿瘤转移、浸润过程与肿瘤新生血管密切相关［21］。多项研究显示VEGF 在肿瘤的发生发展、转移及血管的生成等过程中有着极其重要的作用［22］。VEGF 广泛存在于动物和人体的各种组织中，是血管衍生生长因子家族的成员，也是目前发现的调控血管生成特异性最高、作用最强的因子［23］。在局部组织缺血、创伤修复及炎症反应等病理状况刺激下可通过旁分泌和自分泌的方式在各种恶性肿瘤细胞中释放，可增加细胞质内钙聚集，改变血管内皮基因的表达方式，刺激内皮细胞有丝分裂，促进毛细血管通透性增加和新血管生成，还可调节淋巴微管的生成，促进肿瘤淋巴结的转移［24］。ESM-1是近年发现的一种新型内皮细胞特异性分子，具有调节VEGF 的功能，能促进血管内皮细胞生长，改善肿瘤细胞的微环境［25］。故而，ESM-1、VEGF 与肿瘤的发生发展、转移及浸润的研究成为热点。本实验结果显示，ESM-1 和VEGF 参与宫颈鳞癌的EMT，阻断二者的表达可能为宫颈鳞癌靶向治疗提供新的指导与靶点。

宫颈癌病人临床Ⅰa～Ⅱa 期的病人手术为首选治疗方案，而Ⅱb 期及以上病人的治疗的标准方案是放疗联合含铂药物的化疗。通过检测宫颈鳞癌病人临床Ⅰa～Ⅱa 期的病人宫颈组织中ESM-1 和VEGF 的表达情况及其与EMT 相关蛋白E-Cadherin和Vimentin 的关系，表明ESM-1 和VEGF 促进宫颈鳞癌病人EMT 的发生，并与E-Cadherin 呈负相关，与Vimentin 的表达呈正相关。然而ESM-1 和VEGF能否成为肿瘤靶向治疗的靶点还仍受争议。因地区、经济及卫生等方面的差异，宫颈癌的发病率及死亡率不尽相同，相关蛋白表达率也有差异，而早期筛查及预防的不同，宫颈癌的分子标志物较难得到同意的标准。因而，确定宫颈癌的分子生物学特征，研究与宫颈癌的发生、发展及浸润转移相关的分子机制，有助于宫颈癌治疗方案的制定、疗效的预测和预后判定，并为宫颈癌的治疗提供新的治疗靶点。