脑肌酸激酶/磷酸肌酸系统与中枢认知功能的机制综述

张涵涛，朱 朱，李瑞梅，徐淑怡，陈飞燕，戴建国，陈 琳，赵玉男

南京中医药大学 医学院 整合医学学院，江苏南京 210023

肌酸激酶(creatine kinase，CK)又称肌酸磷酸转移酶，是由两个相同的或极其相近的亚基组成的二聚体酶，包括肌肉型、脑型、杂化型和线粒体型同工酶。CK主要存在于细胞质和线粒体中，是一种与细胞内能量运转、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)再生有直接关系的重要激酶，其与磷酸肌酸(creatine phosphate，PCr)形成了能量缓冲系统。大脑中的CK/PCr系统主要包括两种CK同工酶——胞质脑型CK(brain-type creatine kinase，B-CK)和普遍存在的线粒体CK(ubiquitous mitochondrial creatine kinase，uMtCK)[1]。神经系统所需要的大部分能量也是由线粒体以ATP的形式提供，脑CK/PCr能量缓冲系统在神经细胞复杂的代谢和能量转移网络中发挥着重要作用。认知功能是大脑的主要功能之一，受脑内微环境、神经细胞的数量和结构、突触形态、脑内能量水平等因素影响[2]。认知功能障碍常伴有脑能量代谢的紊乱，提示脑CK/PCr系统的异常可能与认知功能障碍有着密切的联系。本文对近年来相关的研究进行综述，以阐明脑CK/PCr系统与中枢神经系统认知功能障碍的病理生理机制，并为以肌酸(creatine，Cr)或CK为靶点开发新药提供一定的参考。

1 肌酸激酶/磷酸肌酸能量缓冲系统

CK与PCr形成一个重要的能量缓冲系统(图1)：该系统参与转运高能磷酸化合物，把 ATP 从产能区运至需能区，发挥空间上的缓冲作用；同时，在能量需求高或波动较大的细胞充当能量池，发挥时间上的缓冲作用；此外，CK的存在使 PCr 的高能磷酰基能快速转移到二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)生成ATP，加快ATP的生成速度，增加了能量释放的爆发力，维持一个相对较高的ATP/ADP比例，使细胞在机体有高能量需求时仍能发挥正常功能[3-4]。

图1 脑肌酸激酶/磷酸肌酸能量缓冲系统[4]

在脑中，B-CK和uMtCK都有特定的功能。uMtCK利用线粒体内ATP，将其高能磷酸键转移至Cr，形成PCr输出到胞质。在高能量需求时，B-CK利用胞质PCr的能量储备，将ADP转化为ATP供能；而在需求降低时，B-CK又将多余的ATP转化为PCr进行储能，并且在这个过程中多余的Cr也被重新输送回线粒体，在uMtCK的作用下重新转化为PCr[5]。

2 肌酸对认知功能的影响

Cr参与细胞能量的传递、运输和调节，并且以非依赖氧气的方式补充细胞内的ATP[6]。近年来大量研究显示，Cr增补可提高运动员对高强度运动的适应力并促进运动损伤的恢复[7–9]。鉴于Cr在缺氧致神经元损伤时仍具有神经保护作用以及中枢神经系统的高代谢需求特性，通过Cr增补改善认知功能已成为研究热点之一。

2.1 肌酸缺乏与认知功能障碍 在脊椎动物中，Cr可通过饮食和内源性合成获得，进入血液循环后被高能量需求的靶组织吸收[10]。相比于其他组织器官，脑组织中Cr的合成和摄取更为复杂，可分为以下四种不同细胞亚群[11]：1)含有Cr合成途径的两种酶，甘氨酸酰胺转移酶(arginineglycine aminidino transferase，AGAT)和胍基乙酸甲基转移酶(guanidinoacetate methyl transferase，GAMT)；2)只有AGAT或GAMT，需要Cr转运体(creatine transporter，CrT) SLC6A8协助；3)不含有任何合成酶，并且绝对依赖于CrT来吸收其他细胞产生的Cr；4)没有任何合成酶或转运体，也不使用Cr。

AGAT和GAMT缺乏症患者因脑Cr合成障碍、脑内Cr水平降低，表现出发育迟缓、智力迟钝和语言障碍等认知功能损伤，且GAMT缺乏症患者的临床表现较AGAT缺乏者更加严重，这是由于缺乏GAMT会增加神经毒醋酸胍的积累[12-13]。

CrT起着将Cr从血液循环分配到组织中的作用，CrT的突变使细胞摄取Cr的能力丧失[14]。Hautman等[15]发现CrT+/-雌性小鼠的脑Cr水平降低，在Morris水迷宫实验中，登台潜伏期和寻找隐藏平台时间延长，提示CrT+/-雌性小鼠存在一定的空间学习和记忆缺陷；Baroncelli等[16]发现在新物体识别实验中，脑特异性CrT基因敲除的雄性小鼠对熟悉物体的记忆能力下降，并随年龄增加而逐渐加重。临床研究也发现CrT缺乏症患者存在注意力减退、语言功能损伤等认知功能障碍的临床表现[17]。CrT功能受损导致中枢神经系统认知功能障碍的机制可能如下：脑内Cr水平明显降低，使海马CA1区域神经元突触相关蛋白数量显著减少，且打破γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和Tau蛋白的稳态，出现学习记忆能力受损和认知功能障碍[18-20]。

2.2 肌酸增补与认知功能改善 Turner等[6]发现通过补充Cr增加神经系统Cr的水平，可提高缺氧时促肾上腺皮质激素的兴奋性，缓解严重缺氧引起注意力下降的程度。此外，绝经后的女性补充Cr可以改善其认知功能[20]。Shen和Goldberg[21]发现体外补充Cr可延缓低氧诱导的神经元膜的去极化，有利于维持神经元结构和功能的完整性。Mao等[22]研究显示，补充Cr可以激活mTORC1信号(mTORC1信号通路在学习记忆的过程中发挥着关键作用)和增加齿状回突触后蛋白PSD-95，进一步改善大鼠脂多糖诱导的空间记忆和识别记忆障碍。

大量研究显示，补充Cr对神经退行性疾病有一定的改善作用。1)阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)：Brewer和Wallimann[23]发现在无血清培养的神经元中，补充Cr可减轻谷氨酸及β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积对海马神经元的毒性，其中谷氨酸积累和Aβ沉积会严重影响认知功能。在AD模型小鼠中，补充Cr增加了环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化(在学习和记忆过程中起着重要作用[24])并提高了NF-κB抑制剂(NF-κB与学习记忆和突触功能密切相关)、CaMKⅡ(长期记忆形成所需的蛋白质)和PSD-95的表达水平，并减少了Aβ的沉积；在行为学上，补充Cr后小鼠水迷宫实验中，登台潜伏期明显缩短，提示补充Cr可以改善小鼠空间记忆能力[4]。2)亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease，HD)：HD是一种全外显性的常染色体显性遗传病，其致病基因Huntingtin表达Huntingtin蛋白致神经退行性病变，主要表现在运动性神经元的病变，其次是认知障碍。补充Cr给予细胞能量支持，改善神经元的形态和功能，为治疗HD提供可行性方案[25]。3)抑郁症：Pazini等[26]发现Cr增补可以逆转皮质酮抑郁模型小鼠的海马背侧区和腹侧区神经元分化异常，并在一定程度上改善小鼠的情绪和认知功能。4)多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)：MS以脱髓鞘、突触病变和神经变性为特征[27]。中枢神经系统脱髓鞘疾病普遍存在着认知功能受损[28]。有研究显示在脱髓鞘疾病中，增加髓鞘的再形成，可以明显改善小鼠的空间记忆能力，而补充Cr有助于增强少突胶质细胞的线粒体功能并促进少突胶质细胞的存活，从而促进MS的髓鞘再形成，就这暗示了补充Cr治疗MS的可行性[29-30]。

3 肌酸激酶对认知功能的影响

在野生型小鼠的大脑中，B-CK在海马、皮质层深处、小脑颗粒细胞层中有较高的表达水平。早在20世纪60年代有研究发现uMtCK通常与B-CK共表达，这两种CK亚型均高表达于小脑颗粒层细胞、脉络膜丛、海马颗粒和锥体细胞中[31]。神经元需要大量ATP来维持膜的极化、细胞器中的Ca2+内流、神经递质的加工、细胞内信号系统的运行、轴突和树突运输，B-CK和uMtCK与这些重要过程密切相关。在亚细胞水平上，B-CK还与突触囊泡和突触质膜结构功能的维持有关。

Jost等[32]发现B-CK基因敲除的小鼠在海马苔藓纤维连接的形成和维持，以及习惯化、空间学习和癫痫易感性等行为方面表现出明显异常，揭示了B-CK在认知功能中的重要作用；Streijger等[33]对缺乏B-CK和uMtCK基因表达的成年小鼠(CK双敲除小鼠)进行形态学分析，发现CK双敲除小鼠大脑质量减少和海马体积缩小，行为学分析显示该种小鼠空间学习能力严重受损，并表现出较低的筑巢活动和声震反射反应，这些结果表明缺乏B-CK和(或)uMtCK，降低了成年小鼠大脑的突触回路应对认知活动相关挑战的效率。Briones等[34]发现创伤性脑损伤患者B-CK水平降低，而绝大多数创伤性脑损伤患者存在着认知功能障碍。另外，uMtCK与脑源性神经营养因子协同调节海马的学习记忆功能，脑源性神经营养因子在突触可塑性维持过程中发挥重要作用，与学习记忆密切相关[35-36]。以上研究都直接或间接提示了缺乏B-CK和(或)uMtCK可能会影响认知功能。

4 肌酸激酶与神经退行性疾病

神经退行性疾病是由神经元和(或)其髓鞘的丧失所致，以行为、运动和认知功能障碍为主要特征。B-CK活性降低是神经退行性疾病中神经元损伤的标志之一。以下是几种伴有CK异常的神经退行性疾病。

4.1 阿尔茨海默病 蛋白质组学研究显示，B-CK是AD脑内特异性氧化蛋白之一，AD患者脑组织中B-CK的活性明显降低，意味着AD患者脑中稳定的细胞能量状态受到干扰，胶质细胞、神经元和突触的能量供应也会发生改变[37]。Hernández等[38]发现Tau蛋白与B-CK结合可以稳定脑能量代谢，在轴突运输过程中起着关键作用，而AD患者的脑内B-CK被氧化，Tau蛋白无法与B-CK结合，从而使AD患者脑内神经功能受损，学习记忆相关认知功能出现障碍。Fahanik-Babaei等[39]发现给予AD模型大鼠葫芦巴碱可以减轻海马CA1区域的神经元死亡、改变氧化应激相关反应、改善空间记忆和物体识别等相关认知功能。Farid等[40]进一步发现B-CK是葫芦巴碱的直接结合靶点，葫芦巴碱可以穿透血脑屏障进入大脑，结合并激活B-CK，从而促进神经元轴突和树突的生长，改善AD模型小鼠的认知功能，反之使用B-CK抑制剂会拮抗葫芦巴碱诱导的轴突和树突的生长。

4.2 亨廷顿舞蹈病 GABA信号转导中断被认为参与了HD发病的过程，GABA能神经元的功能在很大程度上取决于跨膜氯化物的浓度梯度，其主要受Na+-K+-2Cl-联合转运体和氯化钾协同转运蛋白-2的控制，而Na+-K+-2Cl-联合转运体和氯化钾协同转运蛋白-2的活性受到B-CK的调控[41]。Ju等[42]发现能量失调是HD的一个重要致病因素，包括B-CK在内的三个关键分子与HD发病过程密切相关。Lin等[43]发现突变的Huntingtin基因抑制了B-CK基因启动子的功能，使得HD小鼠脑内B-CK表达水平显著降低，引起神经突起萎缩等病理改变，从而导致与HD相关的神经元功能障碍，而内源性增加B-CK的表达或膳食补充Cr可明显逆转上述病变，这提示了B-CK在HD发病过程中的重要地位。

4.3 多发性硬化症 认知障碍是MS患者最常见的症状之一，可发生在疾病的任何一个阶段[44]。MS患者体内B-CK水平降低，导致了大脑白质中的PCr代谢障碍，使谷氨酸毒性增加，一方面脑白质与认知功能密切相关，另一方面谷氨酸毒性积累会导致少突胶质细胞的胞体和轴突退化，进一步影响认知功能[45-46]。Shen等[47]发现B-CK具有维持信号快速转导的作用，还发现了B-CK与髓鞘蛋白同时表达，表明B-CK可能与髓鞘化有着某种联系。Wang等[48]发现 2-( 2-苯并呋喃酰基)2-咪唑啉在大脑中大量表达，与B-CK结合具有较高的特异性，使用2-( 2-苯并呋喃酰基)2-咪唑啉治疗MS模型小鼠，可以增强B-CK和CaATP酶的活性并降低钙蛋白酶的活性，以保护损伤的神经元。

4.4 其他神经退行性疾病 在皮克病[49]、雷特综合征[50]、弥漫性路易体疾病[51]和双相情感障碍[52]等其他神经退行性疾病中，B-CK的活性和(或)含量均存在不同程度的降低。Xu等[53]发现PD患者体内uMtCK水平显著降低，uMtCK活性与帕金森综合征的进展过程呈正相关。

在上述神经退行性疾病中，CK活性和(或)含量的变化均有不同程度的下降，其引起认知功能障碍的机制主要涉及对神经元树突和轴突的形态、突触的可塑性、细胞内信号系统的运行、神经纤维髓鞘化、氧化应激反应和谷氨酸的积累的影响，药物激活CK或内源性增加CK可以明显改善动物的认知功能，这提示以CK为靶点探索改善认知功能障碍药物的可行性，为药物研发提供了新的思路。

5 脑型肌酸激酶和线粒体肌酸激酶的区别和联系

Lenz等[54]用si-RNA沉默细胞内B-CK和uMtCK基因的表达，发现相比于沉默B-CK基因，沉默uMtCK基因后线粒体的超微结构发生显著变化，这一研究证实了uMtCK在维持内膜的ATP- ADP偶合交换和稳定线粒体内外膜方面的具体作用，提示了uMtCK不仅参与了能量缓冲系统，还保护了线粒体的结构和功能。

有研究对B-CK-/-、uMtCK-/-和双敲除的CK-/-小鼠进行实验，发现与野生型相比，脑PCr水平在B-CK-/-或uMtCK-/-小鼠中无显著变化，而在CK-/-小鼠中明显降低，提示B-CK和uMtCK在PCr代谢上的协同效应[55]。此外，与野生型相比，uMtCK-/-小鼠有较高的谷氨酸水平，B-CK-/-小鼠的总N-乙酰天冬氨酸(NAA)和肌醇水平较低，这提示 uMtCK对认知功能的影响可能与促进谷氨酸的清除有关，而B-CK的作用可能与维持神经元结构/功能完整性、抗神经炎症有关[56-58]。

Meyer等[57]发现uMtCK可以减少丙酮酸氧化，减少活性氧的形成，且发现Cr有抗氧化的作用，但Cr抗氧化作用的发挥是需要激活uMtCK介导的，当uMtCK功能缺失时，胞质型CK可以补偿这种缺失，以确保维持Cr磷酸化和ADP的产生。这提示uMtCK可以调节氧化应激反应，但在神经退行性疾病中检测B-CK水平可能更加有意义。

B-CK和uMtCK在大脑的分布和对认知功能影响的机制上有许多共同之处，也有一定的区别。见表1。

表1 脑内脑型肌酸激酶和线粒体肌酸激酶的区别和联系

6 结语

大量研究提示脑CK/PCr系统对认知功能有明显影响，其机制主要涉及线粒体功能和细胞能量代谢，而且B-CK和uMtCK可能存在某种协同效应。相比而言，B-CK在保持神经元轴突和树突的正常形态、维持神经元结构和功能的完整性上发挥着更重要的作用，而uMtCK可能更偏向于影响线粒体的超微结构。

随着社会的高速发展与人口老龄化的加剧，神经退行性疾病的发病率居高不下，越来越多的老年人面临认知功能障碍的风险，因此，寻找能有效预防或治疗认知功能障碍的药物迫在眉睫。既往大量研究表明CK/PCr能量缓冲系统的激活与认知功能障碍的改善密切相关，这丰富了对认知功能障碍病理生理机制的认识，也提示以Cr或CK为靶点探索改善认知功能障碍药物的可行性，为药物研发提供新的思路。