红壤区杉木根际高效解磷菌的筛选、鉴定及培养条件优化

赵 君，饶惠玲，王耘籽，黄 伟，吴承祯，李 键*

(1.福建农林大学林学院，福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室,福建 福州 350002；2.武夷学院生态与资源工程学院,福建 南平 354300)

磷是植物生长发育、结构组成和生理生化过程的关键元素之一，在农业生产上常通过大量施用磷肥来满足作物对磷元素的需求，但磷肥极易与金属离子形成不溶性磷酸盐进而对磷素起到固定作用[1]，这极大限制了肥料的利用效率[2-3].因此，如何活化土壤中难溶态磷并提高其转化利用效率成为当前土壤化学的研究热点之一[4].

我国南方林区土壤的有效磷含量极低[5]，95%～99%的磷以难溶态存在[6]，严重制约着南方重要用材树种杉木(Cunninghamialanceolata)人工林的可持续经营[7-9].针对杉木人工林经营中面临的低磷胁迫，诸多学者从施肥[10]、树种共生[11]、硅肥配施[12]等方面做了大量有益尝试，虽取得了一些成效，但依旧无法有效、低成本地改善杉木人工林下土壤速效磷短缺的情况.针对南方林区杉木林地的磷素受限问题，如何有效提升杉木对磷的利用效率，对杉木人工林的可持续经营具有重要的现实意义.

活跃在植物-土壤接触面上的微生物群落对于维持植物生长发育和植物健康起着重要作用[13].现有研究认为根际微生物是农作物根际的核心，在改善土壤理化性质方面发挥了极大的作用[14-16].利用根际微生物改善林木对营养元素的吸收状况已有诸多尝试，前期研究从红树林(mangrove)[17]、巨尾桉(Eucalyptusgrandis)[18]、马尾松(Pinusmassoniana)[19]、枫香(Liquidambarformosana)[20]、降香黄檀(Dalbergiaodorifera)[21]等植物根际筛选出了一批具有显著解磷效果的根际微生物[22-23]，这为提升杉木在困难立地条件下的养分吸收效率提供了新思路.吴则焰等[24]提出杉木连栽导致土壤养分逐代降低，进而表现为不同林龄杉木的根际微生物群落存在较大差异.杉木根际磷素含量随着林龄的增加而降低[25]，中幼龄杉木人工林下的土壤微生物数量显著高于其他林龄[26]，且中幼林对养分需求量大.因此，本研究以不同林龄杉木人工林为研究对象，以杉木根际土壤为供试土壤，通过平板定性与摇瓶定量筛选出高效解磷菌，鉴定高效解磷菌株类型.在此基础上，通过单因素实验与正交试验优化高效解磷菌生长条件，以期获得具有较高解磷能力和生长量的菌株，为利用根际微生物提升杉木人工林对根际无效磷的吸收利用效率奠定实验基础，亦可探索利用解磷菌改善杉木人工林地力衰退问题的可行性.

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤样品采集于福建省南平市建阳区溪东国有林场(118°08′～120°31′ E，26°40′～27°20′ N)，地处武夷山脉南侧，属于典型的中亚热带季风气候，冬温夏热，四季分明，季风发达，年均降水量1 700 mm，年蒸发量1 500 mm，年均温大于18 ℃，十分有利于杉木的生长发育.林场前身为低产低效马尾松人工林，2008—2010年逐年砍伐后营造杉桐混交林[27]，林下植被种类主要有苦竹(Pleioblastusamarus)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)、观音座莲(Strobilanthescyclus)、黄瑞木(Adinandramillettii)等.

1.1.1 土壤样品采集及理化性质测定

本实验选取中幼林龄(2，4，10，15 a)杉木人工林，各取3块具有代表性的20 m×20 m样地，每块样地采用五点取样法，铲去表土后深挖10～20 cm，选取具有完整根系的土体，采用抖落法采集根际土壤，同一样地各取样点土壤均匀混合并标号处理，同时采集非根际土壤进行标号处理，将土样装入冰盒带回至冰箱(4 ℃)保存.其中新鲜根际土样用于菌株筛选，非根际土样待风干过筛后进行理化性质测定(表1)，土壤类型均为红壤，其他理化性质采取常规测定方式：全磷测定采用钼锑抗比色法，有效磷测定采用盐酸-硫酸浸提法，有机质测定采用重铬酸钾-外加热法，全氮测定采用半微量凯氏法，水解氮测定采用碱解-扩散法，全钾测定采用碱熔-火焰光度法，速效钾测定采用乙酸铵浸提-火焰光度法，pH测定采用电位法[28].

表1 杉木人工林土壤的基本理化性质

1.1.2 培养基

李豆豆等[29]指出以磷酸三钙为磷源时，菌株解磷量显著高于其他磷源类型，因此采用磷酸三钙无机磷培养基(葡萄糖10.0 g，硫酸铵0.5 g，硫酸镁0.3 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，磷酸三钙5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.5)来分离解无机磷菌株.采用蒙金娜有机磷培养基(葡萄糖10.0 g，硫酸铵0.5 g，硫酸镁0.3 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸钙5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.5)来分离解有机磷菌株[30].发酵基础培养基选用LB液体培养基(胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化钠0.5 g，pH 7.0～7.2)[31].

1.2 解磷菌的筛选、鉴定及培养条件优化

1.2.1 解磷菌分离与纯化

取摇床震荡后的土壤溶液上清液成倍数(10-3，10-4，10-5)稀释，涂于磷酸三钙无机磷培养基和蒙金娜有机磷平板培养基上，每个梯度设置3组重复，置于28 ℃恒温培养箱中(解有机磷菌培养3 d,解无机磷菌培养7 d)[32-33]，记录含溶磷圈菌落数.菌落的纯化采用划线法并培养3～7 d，纯化后将单菌落转移至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，保存于4 ℃冰箱备用[34].

1.2.2 解磷菌筛选

解磷菌筛选采用平板初筛与摇瓶复筛.平板初筛需记录各菌株的溶磷圈直径、菌落直径及二者比值，各菌株设5组重复,取平均值.摇瓶复筛需将初筛得到的菌株接种到液体培养基中，摇床培养7 d(28 ℃，160 r/min)，对培养好的菌株进行离心处理(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，利用钼锑抗比色法检测上清液中的溶磷量，判断各菌株的溶磷能力.

1.2.316SrDNA测序鉴定

利用16SrDNA通用引物序列F27和R1492对筛选得到的细菌进行扩增，纯化后送往上海迈浦生物科技有限公司进行测序，将测序结果提交至RDP(http:∥rdp.cme.msu.edu/)及NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行序列比对分析，选取与GenBank中同源性最高的序列，初步鉴定菌株.

1.2.4 培养优化

培养基组分优化：采用不同碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖、甘露醇)代替基础培养基中的碳源，根据菌液在600 nm下的吸光度(A600)确定最佳碳源.改变最佳碳源质量分数(0.5%，1.0%，1.5%)进行菌株培养以确定最佳浓度.最佳氮源(硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、尿素)及其最适质量分数(0.5%，0.8%，1.0%，1.3%，1.5%)的确定采取相同方式.

培养条件优化：在其他条件不变的情况，分别改变菌株发酵液的pH(5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0，9.0)、装液量(10，20，30，40，60 mL，于100 mL发酵瓶)、接种量(1%，3%，5%，7%，9%，均为体积分数)、培养温度(20，25，28，30，35，40 ℃)，测量对应的A600，确定对应的最适值.

正交试验：根据单因素实验结果，设计四因素三水平正交试验，基于初始pH值(A)、装液量(B)、接种量(C)、培养温度(D)以及不同水平的培养条件进行优化，每个处理设3个重复.

1.3 数据处理

采用Exce1 2010软件进行原始数据的整理、分析及图像绘制，运用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(显著水平0.05)和最小显著差数(LSD)法多重比较，采用Pearson相关系数法确定pH与溶磷量之间的相关关系，运用正交设计助手Ⅱ v3.1处理正交试验数据.

2 结果与分析

2.1 解磷菌的筛选结果

对分离出的菌落进行形态特征判断，经福建省林业科学研究院形态学鉴定分析其培养形态，发现4种不同林龄的杉木根际土壤解磷菌形态各异.所筛选出的解磷菌以不透明的白色、乳白色、浅黄色为主，菌落呈圆形、不规则形，边缘基本整齐，中间以凸起为主，菌株表面大多光滑.不同菌株的生长速度不一致，绝大多数菌株的生长速度较快，可在24 h内生长为菌落成型；但亦存在解磷真菌在48 h后才长势较好，生长速度较缓慢.

不同林龄杉木根际解磷菌数量及种类亦存在差异(表2).从数量来看，杉木人工林下根际解无机磷菌的数量范围为2.12×105～3.64×105cfu/g(cfu为菌落形成单位)，解有机磷菌的数量范围为1.31×105～2.14×105cfu/g.其中，15 a杉木根际土壤的解无机磷菌数量和解有机磷菌数量均显著高于其他林龄(p<0.05)，且类型数最多，而解有机磷菌类型数为9，与4 a 杉木的类型数相同.

表2 不同林龄杉木土壤解磷菌的数量特征

从以上解磷菌中挑选解磷效果具有显著优势的菌株进行溶磷实验，对高效解磷菌进行16SrDNA测序鉴定.通过对杉木根际解磷菌进行平板初筛，无机磷培养基和有机磷培养基中均出现较明显的透明圈，表明根际解磷微生物能够溶解无机磷和有机磷并转化至可被植物或自身吸收利用的有效磷素.本研究共筛选得到具有较明显作用的25株解无机磷菌株和20株解有机磷菌株.对以上菌株进行摇瓶复筛后发现，在固体培养基中溶磷圈直径与菌落直径比值大的菌株，在液体培养基中的解磷能力并不一定显著突出，这与黄鹏飞等[35]关于解磷菌在固体平板和液体培养两种方式下的解磷效果并不存在线性关系的研究结果一致.

图中数据字母不同表示差异显著(p<0.05)，下同.

解磷菌常通过分泌有机酸来溶解难溶性磷，发酵液的pH降低，从侧面可反映出菌株溶磷能力的高低[36-37].本研究在探究解无机磷菌株的溶磷能力时，对菌株培养液的pH进行测定，所测值均低于对照组，这一结果进一步验证了上述结论.发酵液的无机磷溶解量与pH呈极显著负相关性(p<0.01，R2=0.749 7，r=-0.865 9)，解磷能力强的菌株培养液pH较低，反之pH较高，只有个别菌株呈现差异(图1).有机磷溶解量与pH的相关关系并不显著(p>0.05)，解有机磷菌株的溶液pH主要集中于6.58～7.42之间，仅菌株Y3溶液的pH为1.89，呈现出强酸性，与其他菌株差异较大，究其原因，可能是由于大部分解磷菌以酶解为主[38]，而Y3以分泌有机酸来发挥溶磷作用[39-40].

图1 无机磷溶解量与培养液pH的关系

通过复筛，采用单因素方差分析各菌株的无机磷溶解量.无机磷溶解量较空白对照组(CK)均有增加(图2)，增量范围为4.01～235.88 μg/mL，溶磷量范围为6.31～238.08 μg/mL.W1的解磷效果显著高于其他菌株(p<0.05)，溶磷量达238.08 μg/mL；溶解无机磷效果最差的是W15，溶磷量仅为6.31 μg/mL.W1溶磷量是W15溶磷量的37.73倍.

有机磷溶解量较空白对照组均有增加(图3)，增量范围为1.07～11.33 μg/mL，溶磷量范围为4.78～15.04 μg/mL.Y9的解磷效果显著高于其他菌株(p<0.05)，溶磷量达15.04 μg/mL；解磷效果最差的是Y10，溶磷量仅为4.78 μg/mL.Y9溶磷量为Y10溶磷量的3.15倍.

图3 解有机磷菌株的溶磷量

2.2 菌株鉴定结果

经PCR扩增后的16SrDNA基因序列(附录(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20220115.html)图S1和S2)通过核酸BLAST序列比对后，得到相似菌株的登录号与相似度.经鉴定，W1为不动杆菌属(Acinetobactersp.，登录号MZ145066.1)(图4)，Y9为克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.，登录号MZ145064.1)(图5).

图4 菌株W1的系统发育树

图5 菌株Y9的系统发育树

2.3 解磷菌培养条件优化

综合上述实验结果，选用解无机磷效果最好的W1与解有机磷效果最好的Y9进行培养基组分优化和培养条件优化.

2.3.1 单因素实验筛选

菌株生长量对于不同碳源、氮源、初始pH、装液量、接种量、温度的响应有显著差异(图6).

GL.葡萄糖；SU.蔗糖；MA.麦芽糖；LA.乳糖；MAN.甘露醇；SS.可溶性淀粉；AS.硫酸铵；AC.氯化铵；PN.硝酸钾；PE.蛋白胨；YE.酵母粉；UR.尿素.

碳源是微生物进行新陈代谢等活动的主要能量来源[41].6种不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和可溶性淀粉)对W1和Y9的生长量的影响差异显著，W1和Y9以葡萄糖为碳源时的A600值均显著高于其他碳源时，菌株生长效果最好(图6(a))，其次为甘露醇、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖.故改变最适碳源葡萄糖的质量分数(图6(b))，W1在1.0%时生长量显著大于其他质量分数时，而Y9在0.5%时生长量最大.

氮源也是微生物生长发育的重要元素之一.当以酵母粉为唯一氮源时，W1和Y9的生长量显著大于其他氮源时(图6(c))，其次为蛋白胨，且酵母粉和蛋白胨对菌株生长量的影响显著大于其他4种氮源.故设置含不同质量分数酵母粉的培养基，结果表明W1在1.50% 时生长量显著大于其他处理，而Y9在1.25%时生长量最大(图6(d))，且质量分数升高时菌株的A600值变化差异并不明显，表明该菌株对高浓度酵母粉氮源变化并不敏感.

pH 8.0处理下W1生长量最大，但pH 7.0和 7.5 处理下差异性并不显著，故后续正交试验采取上述3种初始pH处理;而Y9生长量主要在pH 5.0～6.0之间呈上升趋势，后续A600值随着pH增加而降低(图6(e)).不同装液量下，菌株生长量显著不同，W1与Y9的最适装液量均为30 mL(图6(f)).不同接种量下，3%，5%，7%接种量的W1菌液A600值差异不显著，而Y9在9%接种量时生长量显著大于其他处理.温度过高或过低也不利于菌株的生长，35 ℃处理下W1生长量显著大于其他处理，而Y9生长量在28，30和35 ℃处理下的差异不显著，因此设计正交试验进一步确定最适温度.

2.3.2 正交试验

设计正交试验，选择4个因素(初始pH值、装液量、接种量和温度)及每个因素设定3个水平.W1的因素A为初始pH值(7.0，7.5和8.0)，因素B为装液量(20，30和40 mL)，因素C为接种量(3%，5%和7%)、因素D为温度(30，35和40 ℃).其中，因素A对W1生长量影响最大，因素C和D次之，W1的最佳培养条件为A2B2C1D3，即初始pH 7.5、装液量30 mL、接种量3%、温度40 ℃(表3).

表3 菌株W1培养条件的正交试验结果

Y9的因素A为初始pH值(5.0，6.0和6.5)，因素B为装液量(20，30和40 mL)，因素C为接种量(5%，7%和9%)、因素D为温度(28，30和35 ℃).由于RD>RB>RC>RA，4个因素对菌株生长的影响程度为温度>装液量>接种量>初始pH，则Y9的最佳培养条件为A2B1C3D1，即初始pH为 6.0、装液量20 mL、接种量9%、温度28 ℃(表4).

表4 菌株Y9培养条件的正交试验结果

正交试验结果与单因素实验结果存在差异，表明各因素之间存在交互作用，而正交试验结果更具备准确性.

3 讨论与结论

逆境情况下，植物受环境影响会激发自身的应激性.邹显花等[42]提出杉木根系通过大量增生来应对低磷胁迫,加快向地生长以应对高磷环境.当土壤有效磷含量丰富时，林木通过自身调节便可获取足够的营养元素，但处于低磷胁迫条件下的林木除自身的应激性外，还需要解磷微生物来推动土壤中无效磷元素的转化以保证供给.

南方地区杉木人工林下土壤有效磷在固定作用的影响下含量降低，根际解磷微生物的应用能够有效缓解低磷压力[43].本研究在杉木根际筛选出的解无机磷菌W1的溶磷量高达238.08 μg/mL，解有机磷菌Y9的溶磷量达15.04 μg/mL.Y9菌株的有机磷溶解量大于范丙全等[44]在杉木根际筛选出的乌博内氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaubonensis)的解磷菌P5(溶磷量为195.61 mg/L)，这可能是因为不同种类的微生物代谢机制具有多样性，进而导致分泌物种类和数量的不同，影响解磷微生物的解磷能力[45]；但也有研究指出，微生物、土壤的空间异质性[46]以及生存环境[47]的差异均会对微生物与植物互作产生影响.

对两株菌株基因序列进行Blast对比得到W1为不动杆菌属，Y9为克雷伯氏菌属.李文等[48]提出不动杆菌可以在农业中应用以提高磷素的溶解量，他所筛选出的JL-1菌株溶磷量为118.04 mg/L，解磷效果显著弱于W1.李梦娇等[49]研究得出克雷伯氏菌属(K.pneumoniae)对于增强植物的溶磷能力具有重要作用，本研究的结果验证了高效解磷菌的溶磷作用显著.庄馥璐等[46]将筛选出的不动杆菌属PsbM8菌株回接拟南芥(Arabidopsisthaliana)后，根系附近有明显的溶磷圈出现，进一步得出不动杆菌属在解磷微生物的筛选与鉴定研究中应用较广泛的结论.目前常见报道的解磷菌主要有固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、欧文氏菌属(Erwinia)、根瘤菌属(Bradyrhizobium)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)和链霉菌属(Streptomyces)[9,34,46].下一步亦可针对不同种属解磷菌的解磷效果差异进行探索.

选用高效菌株进行培养基组分和培养条件优化，明晰菌株的最适宜生存环境，促进其发挥最大功效，为日后田间根际大规模应用奠定基础.培养基优化实验结果表明：W1菌株与Y9菌株分别以1.0%和0.5% 的葡萄糖为最佳碳源，这与李文等[50]提出的不动杆菌的最佳碳源为葡萄糖的结论一致；氮源的最佳选择分别为1.50%和1.25%的酵母粉.南方红壤区多呈酸性，Y9菌株偏向酸性环境，适宜应用于南方杉木根际；而W1菌株偏向碱性环境，可在实际应用过程中加以调节土壤酸碱度，为其生长创造最适环境.韦宜慧等[51]在杉木根际筛选出乌博内氏伯克霍尔德菌的P5菌株生长的pH最适范围为5～6，最适温度为25～30 ℃.目前发现的解磷菌的最优培养条件偏向高温环境，解磷菌的功效可能与温度密切相关，针对杉木主产区土温较低的情况，有效降低目前现有优势解磷菌的最优培养温度是值得探索的方向.

随着微生物与植物互作机制研究的日趋完善，根际微生物在解决林木根际营养元素胁迫问题领域中的应用前景将更加广阔.现有研究主要探讨解磷菌的筛选、鉴定、培养条件优化及其作用机制，以期获得菌株最大生长量，发挥高效解磷菌的最大效用.王志康等[52]提出土壤有机质含量、碳氮比等是解磷微生物发挥作用的限制因子.为了更好地将解磷微生物应用于实际生产，在下一步研究中应深入探讨解磷菌与植物的互作机制，可通过适当调控环境因子，提升为解磷微生物生存、生长所能提供的最大资源供应量，以满足接种解磷菌的繁殖与生长需求，从而为利用微生物改善低磷胁迫环境提供最优的菌种资源支持.