四环素的生物降解研究

苏敏，张悦

四环素的生物降解研究

苏敏，张悦

（宁夏工业职业学院化学工程系，宁夏 银川 750021）

目前，我国是四环素类抗生素的原产大国，也是使用、出口大国，但四环素类抗生素具有明显的免疫毒性、致突变和胚胎毒性等巨大毒理效应，对公共健康和社会环境造成了严重威胁，四环素的降解是人们亟待解决的问题。以四环素为研究对象，枯草芽孢杆菌、无丙二酸柠檬杆菌为微生物菌种，在特定条件下对微生物进行了培养，同时利用微生物对四环素进行了生物降解，利用高效液相色谱法检测其残留量，得到四环素降解率。结果表明：无丙二酸柠檬杆菌对四环素类抗生素具有明显降解效果，而枯草芽孢杆菌对其没有降解效果，但微生物降解速度慢、时间长，不适合大规模的降解，不能满足现代工艺的要求。

四环素；抗生素；生物降解；降解率

四环素类是抗生素中较为便宜的一类，低廉的价格使得四环素在发展中国家大受欢迎，不仅作为药物广泛用于人类和动物疾病的治疗，同时也作为添加剂大量使用，用于提高饲料利用率，促进动物生长。在美国，四环素类抗生素在整个抗生素市场占据了15.8 %的市场份额。我国是四环素类抗生素的原产大国，同时也是其使用及出口大国，随着四环素类抗生素的大量使用，因其较难被动物、植物吸收而排放到环境中造成蓄积，会导致较明显的免疫毒性、致突变和胚胎毒性等巨大毒理效应，对公共健康和社会环境造成了严重威胁。目前，四环素类抗生素残留的无害化处理成为人们亟待解决的问题。本研究主要以四环素为研究对象，对其进行了微生物降解，同时利用高效液相色谱法检测其残留量，旨在此类抗生素的无害化处理，减少环境污染以及对人类的危害，为生态环境中抗生素残留的治理提供可借鉴的方法。

1 四环素的概述

四环素为一种有机化合物，广谱抗菌素，分子式为C22H26N2O7，摩尔质量430.45 g·mol-1，为黄色晶体或粉末，微溶于水和低级醇，溶于稀酸、稀碱和丙酮，在空气中稳定，但易吸收水分，受强日光照射变色。化学结构含二甲氨基，故显碱性；含酚羟基或烯醇基，故显酸性，故为酸碱两性化合物，在酸性或碱性均不稳定，易失活。四环素分子上的酚羟基或烯醇基可与钙离子、铝离子生成黄色络合物，与铁离子形成红色络合物。四环素类抗生素主要包括金霉素、土霉素、四环素。四环素的化学结构如图1所示。

图1 四环素的化学结构

1.1 四环素类抗生素的残留

1.1.1 粪肥中四环素类抗生素残留

在畜禽养殖中，四环素类抗生素是使用最多的抗生素，但使用后不能被完全吸收代谢，约有 30%～90%以母体化合物的形式随尿或粪便排出残留于有机粪肥中，并且在施用粪肥的土壤中长期保留，给环境带来了潜在的风险。

1.1.2 土壤中四环素类抗生素

畜禽粪便作为有机肥运用于土壤为土壤提供养肥是世界上通用做法，粪便中残留的抗生素类物质也随畜禽粪便的利用进入土壤，四环素能被土壤吸附并在长期使用粪便的土壤中积累，四环素在土壤的降解随时间的延长而变缓。

1.1.3 水体中四环素类抗生素残留

20多年前，WATTES第一个报道了地表水中存在抗生素残留物。刘虹[1]研究了贵阳市城市污水、河流及养鱼水域中四环素的残留特征，在研究水体中均可检测到四环素的存在，其中排污口水中的质量浓度达到10 µg·L-1。每年至少有50% 的抗生素是用于畜牧业和水产养殖业[2]，它们不能被动物吸收，有部分以原物或代谢物的形式随粪便和尿液排入环境中，对人类的健康和生存造成不利的影响。

1.2 抗生素的降解途径

抗生素的降解是指抗生素通过生物或非生物的方法使其从大分子化合物转化成小分子化合物并最终转化成水和二氧化碳。进入环境中的抗生素会产生一系列代谢及代谢产物，而产物往往具有更大的毒性[3]。

1.2.1 抗生素的非生物降解

1）光降解。光降解原理是分子吸收光能变成激发态从而引起反应[4]，抗生素分子可直接吸收光子进行化学反应，或光敏剂吸收光能后把能量传递给抗生素分子进行光化学反应，光敏剂可加速抗生素在环境中的降解。研究发现，在可见光照射下，四环素类抗生素通过基态电子转移产生阴离子自由基，并且进一步产生超氧阴离子自由基[5]。

2）水解。四环素类抗生素的水解受到pH、离子强度、温度等条件的影响。LOFTIN等研究发现，四环素在不同温度和pH条件下降解速率差异显著，离子强度对其降解无影响。

3）氧化降解。研究人员对四环素水溶液进行臭氧处理，得到15种产物。研究发现，20 mg·L-1的四环素经5 min臭氧处理可完全降解[6]。

1.2.2 抗生素的生物降解

四环素的生物降解是在微生物的作用下，四环素的结构和性质发生改变，从大分子化合物降解为小分子化合物，最终变为H2O和CO2。光合菌、酵母菌、芽孢杆菌、枯草杆菌、硝化细菌等都具有降解功能。

四环素在不同的环境中因条件不同而发生一系列非生物或生物降解反应，研究其在不同介质中的降解方式、机理、影响因素，对于探究四环素环境污染、减少残留具有重要的意义。

1.3 四环素类抗生素的毒性

1.3.1 四环素类抗生素对植物生长的影响

四环素的残留物对植物种子的萌发和根、茎生长的影响是直观的生态毒理效应指标。四环素对小麦根伸长有抑制效应，对芽伸长有促进作用[7]。

1.3.2 四环素类抗生素对生物体的影响

长时间食用四环素类抗生素会引起动物消化机能失常，同时损坏肝脏。含四环素残留物的污水进入土壤和水中，会通过食物链污染肉品，造成对人体危害。

2 实验方法和步骤

2.1 四环素生物降解

2.1.1 降解菌

枯草芽胞杆菌是一种嗜温性、好氧、产芽孢的杆状细菌，能产生多种抗菌素和酶，对真菌、细菌、病菌等具有较强抑制作用[8]，对纤维素、半纤维素具有较高的降解能力[9]。同时，其具有对低相对分子质量木质素酚型、非酚型类物质的降解能力。它能消耗水体中的有机质，将其分解为小分子有机酸、氨基酸及氨，改善水质。

无丙二酸柠檬杆菌为革兰阴性无芽孢短小杆菌，主要生化特性为西蒙氏柠檬酸盐、精氨酸、鸟氨酸、纤维二糖、醋酸钠。其可以产生的胞内酶，对泰乐菌素具有较强的降解作用。

2.1.2 培养基

枯草芽胞杆菌的培养基（CM）：牛肉膏0.3 g、蛋白胨0.5 g、氯化钠0.5 g、水合硫酸锰微量。

无丙二酸柠檬杆菌的培养基（YPD）：酵母浸膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖1 g。

2.2 实验方法

2.2.1 培养基的配制

在锥形瓶中配制两种菌类的培养液，并对培养液进行灭菌35 min。

2.2.2 菌株的培养

种子液的制备：将活化的菌种接于液体培养基，置摇床中，35 ℃振荡培养75 h，转速125 r·min-1。

摇床培养：分别取10%种子液接于液体培养基CM、YPD中，振荡培养72 h。

2.2.3 涂板

1）制备两种菌类的固体培养液；

2）将固体培养液到入玻璃培养皿中，冷却使其凝固，取100 µL菌液进行涂板；

3）分别将50 mg·L-1的四环素、土霉素加入到培养基CM、YPD中，振荡培养。

2.3 仪器设备

实验所用仪器设备如表1所示。

表1 仪器设备

2.4 菌类培养物质

2.4.1 碳源

牛肉膏是用牛肉制成的一种棕黄色或棕褐色的膏状物，具有牛肉气味，易溶于水，水溶液呈淡黄色，广泛用于细菌培养基中，为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素。

葡萄糖，无色晶体，微甜，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，化学式C6H12O6，是一种单糖、多羟基醛。其为微生物提供碳源，是生物的主要供能物质。

2.4.2 氮源

蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的，外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香气味。蛋白胨富含有机氮化合物，是微生物培养基的主要原料，能为微生物提供碳源、氮源、生长因子等营养物质。

酵母浸膏从面包酵母浸膏、啤酒酵母和假丝酵母乳液精制而成的一种棕黄色的膏状物，酵母浸膏富含蛋白质、氨基酸以及B族维生素、核苷酸、微量元等，是生物培养基和发酵中的主要原料。

2.4.3 无机盐

氯化钠呈白色晶体状，主要来源于海水，易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨，不溶于浓盐酸。其具有潮解性，稳定性比较好，为微生物培养提供无机盐。

3 结果与讨论

3.1 降解色谱测定结果

对180 mg·L-1四环素进行降解色谱测定，结果如表2所示。

表2 对四环素降解色谱测定

3.2 生物降解率

生物降解率计算公式（1）如下：

=（0-t）/0。 （1）

式中：—四环素的降解率；

0—四环素的初始浓度；

t—降解后四环素的残留量。

无丙二酸柠檬杆菌和枯草芽孢杆菌对土霉素降解率如表3所示。

表3 对土霉素降解率表

3.3 实验讨论

通过实验研究发现，无丙二酸柠檬杆菌对四环素的降解效果不是很显著，主要原因在于菌株的培养，不仅与菌体种类有密切关系，还与之后对菌株进行的复壮培养、扩大培养有关，菌类生长对培养条件要求严格，操作不当可能会引入杂菌。同时，菌类对抗生素的降解与培养基中营养条件的配比有密切关系，营养过盛，菌类便减少对抗生素的降解；营养不足，菌类无法维持自身的生长代谢，便培养不出菌株。本次实验是初步探究枯草芽孢杆菌、无丙二酸柠檬杆菌是否能对四环素类抗生素进行降解，仅对其降解效果进行初步检测分析并进行探讨，发现无丙二酸柠檬杆菌对四环素类抗生素具有降解效果，而枯草芽孢杆菌对其没有降解效果。

4 结 论

抗生素对环境的耐药性的选择和诱导可能是造成人类、环境危害的最重要部分，因此对抗生素降解研究是人们研究的重点，微生物既是主要的分解者，又是一些物质的生产者。菌类微生物通过吸附或氧化代谢来降解抗生素，来维持自身的生长。菌类微生物能对抗生素进行相应的降解[10]，具有运行成本低、易管理的特点，但菌类微生物降解速度慢、时间长，相比较而言，不适合大规模的降解，不能够满足现代工艺的要求，因此应对这方面的研究给予足够的重视。

[1] 刘虹．贵州城市污水、河流及养鱼水域抗生素的地球化学行为[D]．广州：中国科学院广州地球化学研究所，2008．

[2] TEUBER M. Veterinary use and antibiotic resistance[J]．, 2001, 4: 493-499.

[3] WU Q F,HONG H L,LI Z H．Progress of research on antibiotic contamination[J].,2010,17(2): 68-72．

[4] YANG G P,SUN X C．Research on photo degradation of pesticides in the sea[J].,2007,37(4)：550-556．

[5] LIN W,WANG H,CHEN X J,et al．Research on degradation of antibiotics in the environment[J].,2009,30(3): 89-94．

[6] 俞道进，曾振灵，陈杖榴.四环素类抗生素残留对水生态环境影响的研究进展[J].中国兽医学报，2004，24（5）：515-517．

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[10] 刘熙敬，胡丽芳，何杰.改性蒙脱石对盐酸四环素降解性能的研究[J].辽宁化工，2021，50（8）：1116-1118.

Study on Bio-degradation of Tetracycline

（Department of Chemical Engineering, Ningxia Vocational and Technical College, Yingchuan Ningxia 750021, China）

At present, China produces, uses and exports large amount of tetracycline antibiotics. But they threaten public health and social environment seriously because of their severe toxicological effects, such as immunotoxicity, mutagenesisi, embryo-toxicity and so on. Therefore, the bio-degradation of tetracycline should be solved immediately. Tetracycline is a kind of organic compounds, and has the quality of stability. In this paper, taking tetracycline as research target, some experiments to culture microbe with bacillus subtilis and citrobacter amalonaticus under certain conditions were carried out. Meanwhile the microorganism was used to biodegrade tetracycline. At last, the degradation rate of tetracycline was got through HPLC. The results showed that citrobacter amalonaticus had obvious degradation effect, while bacillus subtilis had no degradation effect; The microbial degradation process can’t meet the requirements of modern technology due to its slow degradation rate.

Tetracycline; Antibiotic; Bio-degradation; Degradation rate

X172

A

1004-0935（2022）04-0453-04

2019宁夏回族自治区高职教育教学质量工程项目资助。

2021-09-28

苏敏(1983-)，女，宁夏回族自治区银川市人，讲师，硕士， 2007年毕业于宁夏大学化学教育专业，研究方向：基础化学。