痰TB DNA检测对非空洞性肺结核诊断的临床价值

邓勇　　彭云　　邓峥　　欧书强　　曾桃　　李朝亮　　陶学萍

[摘要] 目的 了解痰TB DNA在非空洞性结核中的诊断价值。 方法 按照入院时间顺序，收集江西省萍乡市第二人民医院感染科2019年1—12月住院诊断为非空洞性肺结核患者的临床资料100例，主要包括肺部CT结果、痰抗酸染色、TB DNA，然后进行统计分析。 结果 TB DNA的阳性率为54%，痰抗酸染色的阳性率为27%，两者相比差异有统计学意义（χ2=15.132，P<0.001），73例抗酸染色阴性患者中痰TB DNA阳性31例，TB DNA阴性42例。27例抗酸染色阳性患者中痰TB DNA阳性24例，TB DNA阴性3例。 结论 痰TB DNA检测在非空洞性肺结核中的诊断价值高于痰抗酸染色，值得临床推广，但也有一定的假阴性率，必要时可多次送检。

[关键词] TB DNA;肺结核;非空洞型;痰

[中图分类号] R521          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2022）08-0070-03

Clinical value of sputum TB DNA detection in diagnosis of non-cavitary pulmonary tuberculosis

DENG Yong PENG Yun DENG Zheng OU Shuqiang ZENG Tao LI Chaoliang TAO Xueping

Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital， Pingxiang   337000，China

[Abstract] Objective  To investigate the diagnostic value of sputum TB DNA in non-cavitary tuberculosis. Methods  Clinical data of 100 patients with non-cavitary tuberculosis diagnosed in Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital from January to December 2019 were collected， according to the time sequence of admission. The data mainly included lung CT results， sputum acid-fast staining， and TB DNA. Statistical analysis was conducted. Results  The positive rate of TB DNA was 54%， and that of sputum acid-fast staining was 27%， with statistically significant difference （χ2=15.132， P<0.001）. Among the 73 patients with negative acid-fast staining， 31 patients were positive for sputum TB DNA and 42 patients were negative for TB DNA. Among the 27 patients with positive acid-fast staining， 24 patients were positive for sputum TB DNA and 3 patients were negative for TB DNA. Conclusion  The diagnostic value of sputum TB DNA detection is higher than that of sputum acid-fast staining in non-cavitary tuberculosis. It is worthy of clinical promotion. However， it has certain false negative rate. Samples should be submitted for multiple inspections if necessary.

[Key words] TB DNA; Tuberculosis; Non-cavitary type; Sputum

結核病是一种慢性传染病，数百年来一直威胁着公众健康，目前每年仍然有多达1000 万人罹患结核病[1]，尤其是在发展中国家，而我国结核的疫情大部分地区成下降趋势[2]，但仍不容忽视，尤其是老年和受教育程度低者[3]。结核病的临床诊断程序既费时又费力，传统肺结核诊断依靠肺部影像学和痰抗酸染色进行诊断，在非空洞性的肺结核中，影像学相对更难鉴别，痰抗酸染色阳性率也更低，给临床诊治带来诸多不便。而采用双重实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术进行检测痰中结核分枝杆菌的核酸，可以明显提高检测的阳性率。本文回顾性分析江西省萍乡市第二人民医院收治的100例非空洞性肺结核患者痰结核分枝杆菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和痰抗酸染色结果，对其临床意义进行总结，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1—12月在萍乡市第二人民医院感染科住院临床诊断为肺结核的病例，肺结核诊断标准参照国家卫建委发布的行业标准进行诊断[4]，根据入院时间先后顺序、纳入标准和排除标准进行病例收集，共收集100例符合要求的病例，并详细记录各研究对象的临床资料（姓名、年龄、性别、发病情况、肺部影像学结果、痰抗酸染色结果等）。其中，男83例、女17例，年龄15～87岁，平均（56.7±17.7）岁。所有入组对象均知情同意，并签署知情同意书。

纳入标准：①所有入选对象均具有典型的肺结核的影像学表现或影像学不典型但抗结核治疗有效证实为肺结核;②检测晨痰抗酸染色至少1次者;③经过抗结核治疗后1～3个月后肺部病灶吸收，且随访1年后肺部病灶稳定或纤维化;④顺利规范随访1年者。

排除标准：①合并AIDS、乙型病毒性肝炎、肾功能不全、任何部位肿瘤者;②肺结核病灶影像学表现不典型者;③因出现药物不良反应等原因未顺利完成抗结核治疗疗程者;④随访过程中因患者死亡等任何因素导致失访者。

1.2 方法

所有受检者入院第2天清晨在漱口后咳出的深部痰分装在两个一次性带盖痰液杯子中，分别送检痰抗酸染色和痰结核分枝杆菌核酸（pulmonary tuberculosis deoxyribonucleic acid，TB DNA），然后第2、3天用同样的方法取得痰液标本进行送检两次痰抗酸染色。其中抗酸染色使用冷染法检测，TB DNA采用荧光定量PCR检测。

1.3 痰TB DNA检测流程

1.3.1 DNA提取  取出阴性质控品，8000 rmp离心数秒，吸50 μl至0.5 ml灭菌离心管中，加入50 μl DNA提取液中充分混匀，100℃恒温处理10 min，12 000 rmp离心5 min，备用。

1.3.2 标本处理  向痰液玻璃管中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温放置15～30 min待液化;取液化后标本1.0 ml至1.5 ml离心管，12 000 rmp离心5 min。去上清，沉淀加灭菌生理盐水1 ml混匀，12 000 rmp离心5 min，重复1次。去上清，沉淀加入50 μl DNA提取液中充分混匀，100℃恒温处理10 min，12 000 rmp离心5 min，备用。

1.3.3 PCR扩增  按比例（TB-PCR反应液40 μl/人份+Tap酶3 μl/人份）取相应的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43 μl/管分装至0.2 ml离心管中，备用。向准备好试剂的0.2 ml试剂管中，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品/临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2 μl，或直接加入阳性定量参考品2 μl，8000 rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

1.3.4 编辑  按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量参考品及未知标本，并在Name栏中设置样品名称，选中所有设置样品孔，点击工具栏中P键，选择PRI primer l后关闭窗口。

1.3.5 结果分析  在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰抗酸染色与TB DNA的阳性率比较

总共纳入100例非空洞性肺结核，其中痰抗酸染色阳性27例，阳性率27.00%，其中只有6例为三次痰抗酸染色均阳性，其余均为多次痰抗酸染色中1～2次为阳性，TB DNA阳性54例，阳性率54.00%，两者相比差异有统计学意义（χ2=15.132，P<0.001）。

2.2 痰抗酸染色阴性患者中TB DNA阳性情况

73例痰抗酸染色阴性患者中痰TB DNA阳性31例，TB DNA阴性42例。27例抗酸染色阳性患者中痰TB DNA阳性24例，TB DNA阴性3例。见表1。

2.3 TB DNA阳性患者中痰抗酸染色情况

54例TB DNA阳性的患者中TB DNA数值与抗酸染色阳性情况：TB DNA≤104拷贝的TB DNA阳性例数为22例，痰抗酸染色阳性例数为5例，抗酸染色阳性率9.26%，TB DNA在104到105拷贝之间TB DNA阳性例数为9例，痰抗酸染色阳性例数为3例，抗酸染色阳性率14.81%，TB DNA在105～106拷贝之间TB DNA阳性例数为9例，痰抗酸染色阳性例数为5例，抗酸染色阳性率24.07%，TB DNA>106拷贝的TB DNA阳性例数为14例，痰抗酸染色阳性例数为10例，抗酸染色阳性率42.59%。见表2。

2.4 不同年龄段TB DNA阳性情况

根据患者年龄情况分析，≤60岁患者中TB DNA阳性例数为30例，>60岁患者TB DNA阳性例数为24例，两者TB DNA阳性率相比差异无统计学意义（χ2=0.015，P=0.904）。见表3。

3 讨论

肺结核是呼吸系统常见的一种疾病，主要是因为感染结核分枝杆菌后引发，肺结核可引起咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、盗汗等临床症状。但病灶不仅局限于肺部，也可以侵袭淋巴结、骨骼系统、神经系统等，侵犯神经系统可引起结核性脑膜炎，可导致患者头痛、呕吐、意识丧失等[5]。部分肺结核患者由于存在咳嗽的痰液未吐出，而是咽入胃部，在胃部未被消化液消化的结核杆菌可进入肠道引起肠结核。传统肺结核诊断主要依赖于肺部影像学表现、临床表现和抗酸染色。但实际上，肺结核的影像学表现并不会像教材中描述的那样典型（表现为病变多发生在上叶的尖后段和下叶的背段，密度不均匀、边缘较清楚和变化较慢，易形成空洞和播散病灶），而是出现多种表现，甚至表现为间质性肺炎的磨玻璃样改变，临床上不可避免地易导致误诊、误治的情况发生[6-7]，即便是高分辨率CT在痰菌阴性的肺结核中诊断的阳性预测值仅约60%[8]，因此，肺結核的诊断不能依旧停留在影像学层面[9]。2015年，世界卫生组织批准了雄心勃勃的“消灭结核病”计划，目标是到2035年将结核病发病率降低90%，结核病死亡率降低95%。为了结束全球结核病流行，必须改进诊断措施，提高肺结核确诊率，并针对弱势群体进行有效监测。

在病原學诊断方面，临床上常采用痰抗酸染色和痰培养法，痰抗酸染色操作简便、价格低廉，但受主观因素影响等原因，其阳性率低，敏感性低，容易造成误诊、误治。而痰培养周期长，虽然经过改良后现在的手段可以缩短周期，但目前还未能广泛应用，无法满足临床需求，尤其是对于危重患者，如果等待培养结果再进行治疗的话，则病情将无法得到控制，因此，往往仅适用于疾控中心对耐药的监测及实验室研究。本研究对江西省萍乡市第二人民医院临床诊断为肺结核且影像学为非空洞性的肺结核患者进行3次痰抗酸染色和痰TB DNA检测，发现3次送检痰抗酸染色的累计阳性率仅为27.00%，而送检1次的痰TB DNA的阳性率为54.00%，差异有统计学意义（P<0.05），提示痰TB DNA的阳性率明显高于痰抗酸染色[10]，对于痰TB DNA阴性的患者进行多次送检将进一步提高痰TB DNA的阳性率，且痰TB DNA检测结果在数小时内就可出结果，有助于临床的早期诊断。另外，可以对临床怀疑存在耐药的患者进行TB DNA的标本基因测序，根据耐药基因序列从而检测出是否存在耐药。其中73例痰抗酸染色阴性患者中痰TB DNA阳性例数为31例，而在27例痰抗酸染色阳性患者中痰TB DNA阴性例数为3例，说明痰TB DNA也存在假阴性情况[11]，不排除与痰液送检标本情况有关，因此，必要时也可考虑再次或多次送检痰TB DNA检测以提高阳性率。对54例TB DNA阳性的患者分析发现，31例痰TB DNA滴度<105 copies/ml的患者中痰抗酸染色阳性例数为8例，阳性率为25.80%，提示在低滴度TB DNA的痰液标本中绝大部分痰抗酸染色均为阴性，仅在高滴度TB DNA的痰液标本中才能显示出阳性结果，痰抗酸染色阳性率低，尤其是在结核杆菌滴度低的情况下。根据年龄大小，以60岁为界限进行年龄分组进行组内分析发现，在>60岁组和≤60岁组中TB DNA阳性率无明显差异，提示痰TB DNA阳性情况与年龄大小可能无相关性。但由于痰抗酸染色价格低廉，仍广泛用于临床，因此，在考虑经济因素影响情况下（当然，实际上目前TB DNA价格也非常低），建议对痰抗酸染色阴性的患者，如果临床考虑结核或普通抗生素治疗效果欠佳又存在肺部病灶的患者，有必要行痰TB DNA检测甚至多次检测以提高结核病的诊断阳性率。

当然，PCR检测TB DNA也存在部分缺点，如不能区分检测标本中的扩增信号是来源于死菌还是活菌，对于已经抗结核治疗后的肺结核，如果肺内仍存在已经死亡的结核杆菌，咳出的痰液标本经PCR检测TB DNA仍可得出阳性结果，因此对病情的判断尤其是已经使用了能够杀死结核杆菌的抗菌药物后，应结合临床治疗情况以及其他辅助检查结果进行综合判断[12]。另外，部分肺结核患者不存在咳嗽、咳痰，可以通过支气管镜灌洗获取肺泡灌洗液检测TB DNA，目前本研究人员已在多例无咳嗽、咳痰且肺部病灶不典型的患者的肺泡灌洗液中检测出TB DNA阳性，包括也有研究者发现在胸水等浆膜腔积液及患者的血液中检测到TB DNA阳性[13-14]。

综上所述，痰TB DNA的阳性率在非空洞性肺结核患者中的阳性率明显高于痰抗酸染色，操作性方便，易于临床开展，有助于临床的早期诊断，值得临床推广。但也存在一定的假阴性情况，必要时可多次送检，或者联合其他检测手段如肺泡灌洗液、X-Pert、TB RNA等有助于进一步提高阳性率[15-20]。

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（收稿日期：2021-03-15）