基于网络药理学探讨加减补肺化瘀汤治疗非小细胞肺癌的作用机制▲

覃祥龙 吕婷婷 韦媛菊 柳华英 庞翠英 江 颖 冯 原

(广西中医药大学1 瑞康临床医学院，2 研究生学院，3 第一临床医学院，南宁市 530001，电子邮箱:1357957218@qq.com；广西中医药大学附属瑞康医院4 神经内科，5 呼吸内科，南宁市 530001)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是起源于支气管黏膜、腺体和肺泡上皮的一类恶性肿瘤，分为腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌等。目前现代医学中用于治疗NSCLC的方法比较局限，且伴有较大的副作用，而中医药治疗NSCLC具有独特的优势，副作用较西药治疗小。加减补肺化瘀汤由党参、黄芪等14味中药组成，具有补气活血化瘀的功效，主要用于气虚血瘀型NSCLC的治疗[1]。有研究显示，补肺化瘀汤辅助吉非替尼治疗晚期NSCLC，能改善患者免疫系统的功能，降低血清肿瘤标志物水平，临床疗效满意，药物安全性高[2-3]；补肺化瘀汤结合顺铂+吉西他滨化疗方案治疗NSCLC的疗效较好，能有效地改善患者的免疫指标和高凝状态，稳定目标病灶，并减少化疗药物的毒副作用[4-5]。上述研究结果均提示补肺化瘀汤对NSCLC有一定的治疗效果，但是目前尚无加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的作用机制的相关研究。

本研究运用网络药理学方法，从分子水平上阐述加减补肺化瘀汤成分与靶点之间、靶点与NSCLC之间的潜在联系，分析药物成分、靶点、蛋白质和疾病之间的相互作用关系，从而探讨加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的作用机制，为明确加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的相关机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 加减补肺化瘀汤有效活性成分及其作用靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://tcmspw.com/)搜索并筛选加减补肺化瘀汤中所含中药(党参、黄芪、生地黄、紫菀、川芎、赤芍、丹参、前胡、杏仁、莪术、三棱、半枝莲、白花蛇舌草、甘草)的活性成分，采用胃肠吸收、分布、代谢和排泄效应模型，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18等为限定条件筛选出符合研究标准的有效活性成分。利用TCMSP筛选出加减补肺化瘀汤有效活性成分的作用靶点，使用自学的编程脚本perl将基因名转换为uniProt ID。

1.2 NSCLC相关靶点的获取 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org)检索关键词“non-small cell lung cancer”，以“Relevance score>2”为筛选条件筛选数据库中NSCLC的相关靶点。

1.3 加减补肺化瘀汤治疗NSCLC相关靶点的选取 通过Venny平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，将加减补肺化瘀汤有效活性成分的作用靶点与NSCLC相关靶点进行合并取交集，所获得的共同靶点即认为是加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的相关靶点。

1.4 构建PPI网络并筛选核心靶点 将共同靶点导入STRING网站(https://string-db.org/)，选择“Multiple Protein”，限定物种为“Homo sapiens”，设定最低要求互动分数为中度可信度0.400，导出相关的TSV表格，得到蛋白-蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)网络相关文件。将导出的PPI网络相关文件中的 Node1、Node2、Combined score值导入Cytoscape 3.6.0软件，从而可视化PPI网络，并利用其自带工具NetworkAnalyzer计算Degree值，选取“Degree>90”的靶点，即为核心靶点。

1.5 构建“有效活性成分-核心靶点”网络图 将得到的核心靶点及与其对应的有效活性成分导入Cytoscape 3.6.0软件，构建“有效活性成分-核心靶点”网络图。

1.6 核心靶点的通路富集分析 将1.4步骤选取出的核心靶点导入STRING网站，按照上述步骤获得核心靶点的PPI网络图。同时，将核心靶点上传到Metascape数据库(http://metascape.org/)，然后进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。设定基本参数，物种为“Homo sapiens”，采用“ORA”算法，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。进阶参数设定中，设定“Significance Level”为P<0.05，余为默认设置。

2 结 果

2.1 加减补肺化瘀汤的有效活性成分及其作用靶点 利用TCMSP数据库，共收集到加减补肺化瘀汤有效活性成分342个和靶点4 084个，去重后得到234个有效活性成分和254个靶点。

2.2 NSCLC的相关靶点 共搜索到NSCLC相关靶点4 908个，以“Relevance score>2”为条件进行筛选得到相关靶点4 789个。

2.3 加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的相关靶点 将加减补肺化瘀汤有效活性成分的作用靶点与NSCLC的相关靶点取交集后获得191个共同靶点，见图1。

图1 韦恩图

2.4 加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的核心靶点 共获得14个加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的核心靶点，按照对应的“Degree值”由大到小排序，依次为蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、JUN、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3)、MYC、MAPK1、MAPK8、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)，见表1。

表1 加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的核心靶点

2.5 “有效活性成分-核心靶点”网络图 使用Cytoscape 3.6.0绘制中药“有效活性成分-核心靶点”网络图，结果显示共有198个节点和475条边(见图2)。

图2 有效活性成分-核心靶点网络图

2.6 核心靶点的PPI网络图与GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 将14个核心靶点导入STRING网站，制作PPI网络图(见图3)。GO功能富集分析结果显示，核心靶点富集到16个生物学过程、6种分子功能、3种细胞成分。其中生物学过程主要包括细胞对镉离子的反应、DNA代谢过程的正调控、DNA结合转录因子活性的调节等；分子功能主要包括一氧化氮合酶调节活性、MAP激酶活性、转录因子结合等；细胞成分主要涉及膜筏、囊泡腔、质膜蛋白复合物，见图4。KEGG通路富集分析共获得9条相关通路，其中癌症相关通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、结直肠癌信号通路等与NSCLC关系最为密切(见图5)，而癌症相关通路为富集程度较高的信号通路(见图6)。

图3 核心靶点的PPI网络图

图4 GO功能富集分析结果柱状图

图5 KEGG通路富集分析结果柱状图

图6 癌症相关通路

3 讨 论

在中医中，NSCLC有气阴两虚证、阴虚内热证、脾虚痰湿证、气血瘀滞证等证型。肺癌早期，邪气盛且正气尚足，故病机以邪实为主；肺癌中晚期，机体正气虚弱，外邪易入里化热，同时，肺病及脾，脾虚失运，痰湿内生，阻碍气机，可致气滞、痰湿、血瘀相互胶结，瘀而化热，进而耗伤气阴[6]。

加减补肺化瘀汤由党参、黄芪、生地黄、紫菀、川芎、赤芍、丹参、前胡、杏仁、莪术、三棱、半枝莲、白花蛇舌草、甘草14味中药组成，方中党参补脾益肺，黄芪益气健脾，生地黄具有清热凉血、养阴生津、活血化瘀之功效[7]，紫菀具有润肺下气、化痰止咳之功效[8]。现代药理学研究表明，党参和黄芪均有清除氧自由基、抗氧化、保肝、调节机体免疫功能等功效[9-10]。有研究显示，采用加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的效果确切，可有效地改善患者机体的凝血功能和免疫功能[11-12]。本研究运用网络药理学的方法，探讨加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的机制，共获得加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的核心靶点14个，包括AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、EGFR、JUN、CASP3、MYC、MAPK1、MAPK8、EGF、STAT3、PTGS2、ESR1。大部分靶点与NSCLC的发生、发展具有一定的关系。(1)AKT1作为蛋白激酶，与细胞的增殖、生长、凋亡密切相关[13-14]，同时还可促进受体细胞的自噬激活[15]；研究表明，AKT1直接参与微小RNA-99a介导的肿瘤抑制过程[16]，参与微小RNA-5481诱导的NSCLC细胞迁移和侵袭的抑制过程[17]。(2)IL-6是经典的炎症指标，可用于预测NSCLC患者的疗效[18]。(3)MAPK3/1信号通路在调控NSCLC细胞间充质特性方面起着关键作用，阻断该信号通路可以提高EGFR抑制剂对NSCLC细胞的干预效果[19]；此外，抑制MAPK1的表达可降低NSCLC细胞对吉非替尼的耐药性，并阻止细胞的增殖、迁移和侵袭[20-21]。(4)有学者指出，肺腺癌中VEGFA与程序性细胞死亡蛋白1的蛋白和mRNA表达密切相关[22]，且与肿瘤细胞的侵袭和潜在转移有一定的关联[23-24]。(5)携带常见的EGFR基因突变可能与NSCLC患者预后不良相关[25]，而抑制EGFR可以显著降低凋亡前细胞表面CD47的表达，有利于树突状细胞有效地吞噬癌细胞[26]，因此EGFR的酪氨酸激酶抑制剂在NSCLC的治疗中发挥着重要的作用[27]。(6)MAPK通路组分当中的c-Jun N端激酶与促进NSCLC细胞增殖和NSCLC进展有关[28]，而生物活性成分重楼皂苷Ⅰ通过调控c-Jun的表达可以抑制NSCLC细胞的生长[29]。(7)上调CASP3的表达可以抑制NSCLC细胞株A549的活力，并诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖[1,30-33]。(8)研究表明，蛋白激酶C-iota 可通过上调c-MYC/葡萄糖转运蛋白1信号通路而参与NSCLC细胞中糖代谢的葡萄糖积累和糖酵解过程[34]，并阻断c-MYC介导的自噬功能及BIN1与c-MYC之间的相互作用，从而促进NSCLC的发展[35-36]；此外，直接下调c-MYC的表达，会使NSCLC细胞增殖[37]。(9)EGF激活的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和缺氧诱导的毛细血管扩张性共济失调突变可抑制毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白的表达，促进转录因子E2F1的表达，进而上调肺腺癌细胞中核转运蛋白α2的表达，具有潜在的抑癌作用[38]；此外，降低EGF诱导的AKT信号转导可抑制肺鳞腺癌细胞的增殖和迁移[39]。(10)STAT3信号通路也与NSCLC的发生、发展有关，泛素特异性肽酶28可通过诱导STAT3信号通路促进NSCLC细胞的生长[40]，而下调STAT3可增加癌细胞对吉非替尼的敏感性[41-43]。(11)研究表明，抑制PTGS2可显著地逆转耐药NSCLC体外和体内的化疗耐药，故PTGS2可作为一种辅助治疗靶点，提高NSCLC患者对治疗药物的应答率[44]。由此推测，补肺化瘀汤的有效活性成分通过作用于上述多个靶点，从而发挥治疗NSCLC的作用。已有研究表明，补肺化瘀汤联合化疗治疗NSCLC可以有效地降低患者的VEGF水平,改善免疫功能,减轻毒副作用[45]；补肺化瘀汤联合吉非替尼治疗晚期EGFR突变型NSCLC可提高疗效,降低患者的转移率和复发率[46]。

GO功能富集分析结果显示，加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的过程与细胞对镉离子的反应、DNA代谢过程的正调控、DNA结合转录因子活性的调节等生物学过程相关。KEGG信号通路富集分析结果提示，加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的核心靶点主要涉及癌基因相关信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、结直肠癌信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路等。其中癌症相关通路为富集程度较高的信号通路，其包含了MAPK、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)等信号通路。Chen等[47]的动物实验表明，通过靶向神经纤维蛋白1以激活ERK信号传导，可显著地增强NSCLC细胞对埃罗替尼的耐药性；Hou等[48]的体内外细胞实验显示，下调PI3K信号通路可抑制肺腺癌干细胞样细胞的生长；Lu等[49]的动物实验表明，阻断MAPK/C-Jun N末端激酶通路可以抑制NSCLC细胞的增殖并诱导其凋亡，从而抑制肿瘤的生长,起到抑癌作用。结合所获得的核心靶点和KEGG信号通路，我们推测加减补肺化瘀汤中的多个活性成分可能通过AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA等靶点调控PI3K/ERK、MAPK等多种信号通路达到治疗NSCLC的作用。

综上所述，本研究利用网络药理学的方法研究加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的作用机制，发现加减补肺化瘀汤治疗NSCLC的作用机制可能与AKT1、CASP3、VEGF、ERK等靶点有关。加减补肺化瘀汤中的多个活性成分可能通过以下途径发挥治疗NSCLC的作用：调节AKT1以调控肺癌细胞的增殖、转移，降低VEGF水平以减少癌细胞的侵袭和潜在转移，调节ERK以提高EGFR抑制剂的治疗反应等过程，促进树突状细胞有效地吞噬癌细胞，降低EGF诱导的AKT信号转导、增加CASP3、c-MYC基因的表达以诱导细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖转移，下调STAT3以增加癌细胞对治疗药物的敏感性等。