宫颈鳞癌组织中miR-448、KDM2B表达水平与术后复发的相关性研究

张文莉，王彩丽，冯彩霞，王蕊，高瑞，李光，张兴旺

宫颈鳞癌是妇科常见生殖道恶性肿瘤之一，近年来其发病率有所上升，并呈年轻化趋势。宫颈鳞癌是宫颈癌最常见的病理类型，约占70%以上[1]，其发生发展受多因素、多阶段长期作用影响，分析其可能的分子机制，对宫颈鳞癌早期诊断、预后干预具有重要临床意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类单链非编码小分子RNA，通过与靶基因3’-非翻译端结合抑制其表达来参与肿瘤的增殖、分化、迁移和凋亡[2-3]。miRNA在肿瘤中的作用越来越受到关注。研究发现[4]，miR-448在非小细胞肺癌中低表达，上调miR-448可抑制肿瘤细胞增殖分化、迁移侵袭作用，可能通过靶向锌指E盒结合的同源盒蛋白2发挥抑癌作用。关于miR-448在宫颈鳞癌中的表达尚不清楚。赖氨酸特异性脱甲基酶2B(lysine-specific demethylase 2B，KDM2B)参与细胞的正常生命进程，如细胞衰老、细胞分化、干细胞自我更新等[5]。杨慧兰等[6]报道，KDM2B在恶性卵巢癌中表达上调，肿瘤低分化、淋巴结转移患者KDM2B阳性表达率更高，提示KDM2B参与卵巢癌的发生发展进程。KDM2B是否在宫颈鳞癌中发挥同样的分子作用尚未见报道。因此，本研究通过检测宫颈鳞癌组织中miR-448、KDM2B信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达情况，分析其可能的作用机制，探究其临床价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年8月—2020年3月于榆林市第一医院妇产科行腹腔镜手术及术后病理检查确诊为宫颈鳞癌患者96例为研究对象，年龄44～72(49.57±5.63)岁，年龄>50岁者32例，年龄≤50岁者64例；肿瘤分化程度：高分化50例，低、中分化46例；FIGO分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ期49例；浸润宫颈纤维肌壁深度≤1/2者34例，浸润宫颈纤维肌壁深度>1/2者62例；有脉管癌栓39例，无脉管癌栓57例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移56例。手术获取患者宫颈鳞癌组织和癌旁正常宫颈组织。本研究获得医院伦理委员会批准(榆医伦审2017-32号)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①均经病理组织检查确诊；②术前3个月内无内分泌类、激素类或抗生素类药物治疗史；③无围产期症状；④临床资料完整。(2)排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②严重心、肝、肾、肺等器质性疾病；③术前行放疗、化疗、生物治疗等；④失访患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 miR-448、KDM2B mRNA表达水平检测：采用荧光定量PCR技术(荧光定量PCR仪购自拓赫机电科技上海有限公司，型号THT-96G)检测miR-448、KDM2B mRNA表达水平。先取宫颈鳞癌组织和癌旁正常宫颈组织各20 mg置于裂解液200 μl中，捣碎、匀浆，再利用TRIzol试剂(上海通蔚生物有限公司)提取总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA纯度，以OD260/OD280值1.8～2.0为纯度较好。使用逆转录试剂盒(上海通蔚生物有限公司)将RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，所有过程均严格按照试剂盒说明书操作步骤执行。循环参数：95℃ 预变性3 min，90℃ 变性10 s，60℃ 退火20 s，72℃ 延伸30 s，共40个循环。利用2-△△Ct法计算miR-448、KDM2B mRNA表达水平。以U6为内参，miR-448上游引物为5’-CATTACGGAGCCCAGTGTT-3’，下游引物为5’-CTGATTCCCCCGACATFCTT-3’；KDM2B mRNA上游引物为5’-TCGGACTAAGCTTGAGCCATA-3’，下游引物为5’-CGAAGTCGCCCAATAGAATCG-3’；U6上游引物为5’-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为5’-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3’。重复3次，取平均值。引物由北京旷博生物技术股份有限公司合成。

1.3.2 KDM2B蛋白检测：采用免疫组织化学法(上海通蔚生物有限公司)对宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织进行SP染色，检测过程均按照试剂盒说明书步骤操作，工作液浓度1∶200，以磷酸盐缓冲溶液代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取3个高倍清晰视野，最终结果取平均值。按染色强度计分：细胞未着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分；按阳性细胞所占百分比计分：<25%计1分，25%～50%计2分，>50%计3分。染色强度计分与阳性细胞所占百分比计分乘积作为最终结果[8]，≥3分判定为阳性(+)，否则为阴性(-)。

1.3.3 病情复发情况：术后第1天开始随访，以门诊或电话方式随访18个月，前6个月内每2个月随访1次，之后每3个月随访1次，随访终止日期为患者复发或2021年9月30日。复发判断标准[9]：患者有复发症状，盆腔、细胞学及常规影像学检查异常，且通过活检或手术确定。根据随访期间宫颈鳞癌患者复发情况，将其分为复发组37例和未复发组59例。

2 结 果

2.1 不同组织中miR-448、KDM2B mRNA表达水平比较 宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平明显低于正常宫颈组织(P<0.01)，KDM2B mRNA表达水平明显高于正常宫颈组织(P<0.01)，见表1。

表1 宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织中miR-448、KDM2B mRNA表达水平比较

2.2 复发组与未复发组患者宫颈鳞癌组织中miR-448、KDM2B mRNA表达水平比较 复发组患者宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平低于未复发组，KDM2B mRNA水平明显高于未复发组(P<0.01)，见表2。

表2 复发组和未复发组宫颈鳞癌组织中miR-448、KDM2B mRNA表达水平比较

2.3 宫颈癌组织和正常宫颈组织KDM2B蛋白表达比较 免疫组织化学染色显示，KDM2B主要定位于宫颈鳞癌细胞的细胞核，阳性表达产物由弱到强依次呈浅黄色、黄棕色、棕色或深棕色分布，见图1。宫颈鳞癌组织中KDM2B蛋白阳性64例(66.67%)，正常宫颈组织中KDM2B蛋白阳性33例(34.38%)，2组比较差异有统计学意义(χ2=20.023，P<0.001)。

图1 宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织中KDM2B蛋白表达情况(免疫组织化学染色，×100)

2.4 miR-448、KDM2B mRNA表达水平在不同宫颈鳞癌患者临床病理参数中比较 miR-448、KDM2B mRNA表达水平在宫颈鳞癌患者年龄、浸润深度、是否合并脉管癌栓方面比较差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴结转移患者宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平明显低于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)，KDM2B mRNA表达水平明显高于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)，见表3。

表3 miR-448、KDM2B mRNA表达水平在不同宫颈鳞癌患者临床病理参数中比较

2.5 miR-448与KDM2B mRNA表达的相关性分析 宫颈鳞癌组织中miR-448与KDM2B mRNA表达水平呈负相关(r=-0.605，P<0.001)。

2.6 影响宫颈鳞癌患者术后复发的危险因素分析 以宫颈鳞癌患者术后是否发生复发为因变量(1=是，0=否)，以肿瘤分化程度(1=低中分化，0=高分化)、FIGO分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴结是否转移(1=是，0=否)、miR-448和KDM2B mRNA连续变量为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，肿瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、miR-448低表达、KDM2B mRNA高表达是影响宫颈鳞癌患者术后发生复发的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响宫颈鳞癌患者术后复发的危险因素Logistic回归分析

3 讨 论

miRNA是一类由20～22个核苷酸组成的非编码核酸单链小分子，通过抑制靶mRNA翻译或转录后水平参与各种生理调节[10-11]。不同的miRNA或同一miRNA在不同肿瘤中可能存在表达异质性。miR-448是一种常见miRNA，研究发现，胰腺癌组织和细胞中miR-448呈现低表达，miR-448过表达可抑制胰腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖[12]。另有国外学者研究发现，非小细胞肺癌细胞中miR-448表达下调，miR-448过表达通过抑制非小细胞肺癌中的胰岛素受体底物2表达来抑制细胞增殖、转移和上皮间质转化，提示miR-448在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因作用，可逆转疾病进展和不良临床结局[13]。Pu等[14]研究报道，在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中，miR-448表达降低而赖氨酸特异性脱甲基酶5B表达升高，且miR-448表达与患者的N分期、淋巴结转移有一定关系，得出赖氨酸特异性脱甲基酶5B介导的miR-448上调通过抑制转化生长因子β诱导转录因子1抑制甲状腺乳头状癌细胞进展，从而减缓肿瘤生长。本结果显示，宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平明显低于正常宫颈组织，与Pu等[14]研究类似，表明miR-448可能与宫颈鳞癌的发生有关。进一步研究发现，宫颈鳞癌患者肿瘤分化程度越低、FIGO分期越高，其miR-448表达水平越低；且发生淋巴结转移患者宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平显著低于无淋巴结转移患者，表明miR-448可能参与宫颈鳞癌患者肿瘤分化、侵袭和转移过程，高水平miR-448发挥抑癌作用[15-17]。

表观遗传因子KDM2B是一种新型致癌因子。Quan等[18]研究报道，KDM2B通过单极纺锤体—结合蛋白1调节Hippo通路，促进胰腺导管腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。侯海瑞等[19]研究显示，恶性卵巢组织中KDM2B呈高表达，且与肿瘤组织分级、淋巴结转移、FIGO分期相关。本研究结果显示，宫颈鳞癌组织中KDM2B呈高表达，其在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，肿瘤低、中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴结转移患者宫颈鳞癌组织中KDM2B mRNA表达水平明显高于高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者，表明高水平KDM2B对宫颈鳞癌的发生和进展起促进作用，与其他研究表达趋势一致[20-22]。最近一项研究发现，KDM2B可激活前列腺癌肿瘤细胞中的黏着斑激酶(FAK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)位点，证实了FAK/PI3K信号通路在调节前列腺癌细胞迁移中的作用，揭示了组蛋白脱甲基化酶可能通过协调不同信号通路来共同参与肿瘤细胞的迁移[23]。Hong等[24]研究发现，miR-448通过刺激糖酵解促进胃癌细胞增殖，通过生物信息学方法筛选出KDM2B是miR-448的候选转录抑制因子，并利用荧光素酶实验证实了KDM2B是miR-448的直接靶点，在胃癌细胞中发挥重要作用。本研究利用Pearson相关性分析发现，宫颈鳞癌组织中miR-448和KDM2B mRNA表达水平呈负相关，推测低水平的miR-448可能靶向上调KDM2B表达，参与宫颈鳞癌细胞增殖分化、迁移侵袭等过程，具体作用方式或机制还需开展体外实验进一步分析验证。研究显示，miR-448低表达的肺癌患者预后较差，而KDM2B阳性表达的胃癌患者中位生存期较短[20，25-26]。本研究中，复发组宫颈鳞癌组织中miR-448表达水平较未复发组低，KDM2B mRNA表达水平较未复发组高，与既往研究相似，表明miR-448和KDM2B mRNA表达可能与宫颈鳞癌患者术后复发情况有关。本研究还发现，miR-448低表达、KDM2B mRNA高表达是影响宫颈鳞癌患者术后发生复发的独立危险因素，表明miR-448和KDM2B可能作为指示宫颈鳞癌患者术后复发的潜在指标。

综上所述，宫颈鳞癌患者肿瘤组织中miR-448呈低表达，KDM2B呈高表达，二者可能在分子水平上存在靶向关系，共同作用参与肿瘤细胞增殖分化、迁移侵袭等过程，并可作为指示宫颈鳞癌患者术后复发的潜在指标。具体作用机制有待进一步体外实验研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张文莉、王彩丽：设计研究方案，课题设计，实施研究过程，论文撰写；冯彩霞、王蕊：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；高瑞：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；李光、张兴旺：进行统计学分析