高效液相色谱法测定慢性胃炎颗粒中芍药苷的含量

赵明，余春辉，詹思

1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330001；2.丰城市中医院，江西 丰城 331100

慢性胃炎颗粒为丰城市中医院拟申请备案院内制剂，该制剂由当归、白芍、木香、陈皮、厚朴、鸡内金、枳实、沉香、延胡索、甘草十味中药制成。其功能主治为疏肝理气止痛，养血活血和胃，用于肝郁气滞，胃脘胀痛，嗳气返酸等。为了建立慢性胃炎颗粒质量标准，为制剂报批备案提供确实可行的技术依据，我们选定方中主药白芍中的有效成分芍药苷作为定量指标控制，来有效地控制本品的质量。实验证明，采用高效液相色谱法对本品中的芍药苷进行定量，方法简便、灵敏，重现性好。

1 仪器与试药

安捷伦G1314B检测器，G1316A柱温箱，G1329B 自动进样器，G1310A输液泵，G1322A脱气机。岛津LC-20AT 输液泵,SIL-20A 自动进样器，SPD-20A 检测器，CTO-20A 柱温箱，DGU-20A5R 脱气机，依利特（4.6 mm×250 mm，5 μm）C18 柱，FA1004B电子天平；色谱纯乙腈，其他试剂均为分析纯；芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院提供，编号：110736-202044，含量96%）；慢性胃炎颗粒（丰城市中医院制剂室提供，每袋15 g）。

2 方法与结果

2.1 系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1 进行梯度洗脱；检测波长为230 nm，柱温30 ℃。照此条件分析，芍药苷对照品和制剂中的其他组分均能达到基线分离（见图1 和图2），理论板数按芍药苷峰计算均大于2 000，缺白芍的阴性样品无干扰，专属性良好（见图3）。

图1 芍药苷对照品溶液HPLC图谱

图2 慢性胃炎颗粒供试品溶液HPLC图谱

图3 缺白芍的阴性样品溶液HPLC图谱

表1 流动相洗脱条件

2.2 波长选择

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含60 μg 的溶液，即得。

取芍药苷对照品溶液进行光谱扫描，结果显示对照品在232.52 nm 处有一较大的吸收峰，参照《中国药典》2015 年版一部白芍药材中芍药苷含量测定项下的检测波长为230 nm，选择230 nm 作为检测波长。

2.3 流动相的选择

以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1 中的条件进行梯度洗脱，芍药苷与其他组分分离完全，结果满意。

实验对5 种流动相进行了对比，流动相Ⅰ：乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺（13∶87∶0.04）；Ⅱ：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；Ⅲ：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（28∶72）；Ⅳ：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱1），上述条件均因色谱峰峰形差，杂质峰干扰较大，最终选择了流动相Ⅴ：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱2），详见表2。

表2 五种不同流动相比较（n=2）

2.4 供试品溶液的制备

取样品约6 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加稀乙醇35 mL，超声处理（功率240 W，频率45 Hz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.1 不同提取溶剂的比较 试验对比了70%乙醇及50%甲醇不同溶剂超声的提取方法，结果使用稀乙醇提取芍药苷含量为0.93 mg/g，使用50%甲醇提取芍药苷含量为0.67 mg/g，表明70%乙醇提取的供试品芍药苷含量明显高于50%甲醇提取的，故确定提取溶剂为70%乙醇。

2.4.2 不同提取方法的比较 试验对比了70%乙醇超声及70%乙醇回流不同提取方法，结果使用70%乙醇超声提取芍药苷含量为0.93 mg/g，使用70%乙醇回流提取芍药苷含量为0.94 mg/g。可见70%乙醇超声与回流提取的供试品中芍药苷含量相差不大，但超声方法比回流方法操作简单、省时、节能，故确定提取方法为70%乙醇超声。

2.4.3 不同提取时间的比较 试验对比了70%乙醇超声15 min、30 min 及45 min 的不同提取时间，结果见表3。

表3 打开不同提取时间的比较

70%乙醇超声提取15 min 的供试品，芍药苷含量明显低于30 min 和45 min，而70%乙醇超声提取30 min 与45 min 供试品芍药苷含量相差不大，故确定提取时间为稀乙醇超声提取30 min。

2.5 柱温的考察

按正文含量测定方法分别在柱温25 ℃、30 ℃、35 ℃条件下测定，结果见表4。

表4 不同柱温的比较

由上表可见：温度对含量测定的结果相差不大，再根据《中国药典》2015 版一部白芍药材含量检测方法中未明确规定柱温范围，故对色谱条件的柱温不做要求。

2.6 色谱柱的考察

按正文含量测定方法分别用依利特C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和月旭C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）两种不同品牌的色谱柱测定，两款色谱柱测定结果无明显差异，耐用性良好。

2.7 线性关系的考察

精密称取芍药苷对照品13.80 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取5 mL至100 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，得66.24 μg/mL。再分别精密吸取1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、10 μl，按正文中色谱条件分析，测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，芍药苷对照品的量（X）为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=1 488.4X+7.751 5，r=0.999 9。表明芍药苷在0.066 24 μg～0.662 40 μg 范围内具有良好线性关系。

2.8 精密度试验

分别精密吸取芍药苷对照品溶液（66.24 μg/mL）10 μL 重复进样6 次，测定峰面积，各对照品溶液的峰面积的RSD 均小于2%。精密吸取本品供试品溶液各10 μL，重复测定6 次，结果样品中芍药苷含量的相对标准偏差为0.43%，表明此法精密度良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取供试品溶液各10 μL，分别于0、2、4、6、8 h 注入液相色谱仪进样测定一次，在放置8 h 内，芍药苷的峰面积基本一致。表明芍药苷甲醇溶液放置8 h 内稳定性良好。

2.10 样回收率试验

取同一批已知含量的慢性胃炎颗粒样品（批号20200601，芍药苷含量0.926 mg/g）6 份，每份约1 g，精密称定，分别定量加入适量芍药苷对照品，按正文中含量测定项下方法测定含量。结果见表5，表明此法加样回收率良好。

表5 芍药苷回收率试验结果

2.11 样品含量测定及限量规定

样品以芍药苷为含量控制指标，处方中白芍药材经检测合格后投料制剂，测定结果见表6，不同批次制剂中芍药苷含量在0.412～0.926 mg/g 之间，药材到制剂的平均转化率为23.63%。

表6 制剂中芍药苷含量及转化率结果

根据上述测定结果，结合《中国药典》2015 年版一部白芍药材中规定的芍药苷含量限度，以及本品芍药苷的转化率，暂将样品每克含白芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于0.40 mg。

3 讨论

白芍为慢性胃炎颗粒中的主药，芍药苷是中药白芍的主要有效成分，具有舒张平滑肌细胞的作用和一定的免疫调节功能，同时具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥作用。用紫外可见分光光度计对芍药苷对照品溶液进行光谱扫描，确定230 nm 作为检测波长，本研究中，对5 种流动相进行了对比，结果显示在乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）系统中，样品分离度符合要求，故拟定流动相系统选择乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）。提取溶剂分别考察了70%乙醇、50%甲醇，同法测定含量，结果70%乙醇的溶出量更大，拟定提取溶剂为70%乙醇。同时对提取时间作了比较，超声提取30 min 和45 min，芍药苷含量差异不大，因此采用超声提取30 min，既方便又省时。通过研究，本方法具有较好的重复性和较高的精密度，方法简单、准确，能有效控制产品的内在质量，为慢性胃炎颗粒质量标准的制定提供了科学根据。