红景天苷在高海拔地区创伤性慢性创面愈合中的作用及其研究

祁永章 陈亚莉 王滋兴 曹晓婷 沈从墨

[摘要]目的：研究紅景天苷在高海拔地区干预大鼠创伤性慢性创面后对创面愈合的影响、微血管的表达及LDH活性检测。方法：选取75只成年SD雄性大鼠，按照随机数字表法将大鼠分为3组，每组25只，并进行创伤造模。造模完成后，一般创面组只用生理盐水纱布湿敷创面，慢性创面组在此基础上连续肌注7 d氢化可的松（80 mg/kg），红景天苷组则连续肌注7 d氢化可的松（80 mg/kg），并在创面湿敷溶有红景天苷的生理盐水纱布。通过分光光度计分别检测造模3、7、14 d后各组的乳酸脱氢酶（LDH）活性。HE染色及CD31免疫组织化学染色，观察第14天肉芽组织的新生毛细血管分布情况及微血管密度。第7、14、21、28 d观察各组创面愈合情况，计算创面愈合率。结果：红景天苷组LDH活性在造模后3、7、14 d均低于一般创面组及慢性创面组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。第14天时，红景天苷组HE染色下创面新生毛细血管，CD31免疫组织化学染色下CD31表达及微血管密度均高于一般创面组及慢性创面组（P<0.05）。红景天苷组创面愈合率明显高于一般创面组及慢性创面组（P<0.05），红景天苷组创面愈合情况最好，皮肤边缘纤维组织增生最少，创面未见明显渗出及炎症反应。结论：红景天苷干预可促进大鼠创伤性慢性创面的愈合，促进微血管生成，减轻组织损伤，加速创面愈合。

[关键词]高海拔地区;红景天苷;大鼠;慢性创面;创面愈合率;乳酸脱氢酶

[中图分类号]R632.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）03-0096-04

Study on the Role of Salidroside in Traumatic Chronic Wound Healing in High

Altitude Area

QI Yongzhang，CHEN Yali，WANG Zixing，CAO Xiaoting，SHEN Congmo

（Department of Burns and Plastic Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China）

Abstract： Objective To study the effect of salidroside on wound healing， microvascular expression and LDH activity after intervening in traumatic chronic wound in rats at high altitude. Methods Forty five SD male rats were selected to make trauma models.The rats were divided into 3 groups according to the random number table method，which were general wound group，chronic wound group and salidroside group.In the general wound group， only normal saline gauze was used to wet compress the wound， in the chronic wound group， hydrocortisone（80 mg/kg） was injected intramuscularly for 7 days，and in salidroside group， hydrocortisone （80 mg/kg） was injected intramuscularly for 7 days， and salidroside dissolved normal saline gauze was wet applied to the wound.The activity of lactate dehydrogenase （LDH） in each group was detected by spectrophotometer in 3rd， 7th， 14th day.Hematoxylin eosin staining and CD31 immunohistochemical staining were performed to observe the distribution of new capillaries and microvessel density in granulation tissue on 14th day . The wound healing of each group was observed on the 7th，14th，21st，28th day to observation and the wound healing rate was calculated. Results LDH activity in salidroside group was lower than that in general wound group and chronic wound group at 3rd， 7th and 14th days，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. On the 14th day， the expression of CD31 and microvessel density in salidroside group were higher than those in general wound group and chronic wound group，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. The wound healing rate of salidroside group was significantly higher than that of general wound group and chronic wound group，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. The wound healing in salidroside group was the best， the proliferation of fibrous tissue on the edge of the skin was the least， and there was no obvious exudation and inflammatory reaction on the wound. Conclusion The intervention of salidroside can promote the healing of chronic traumatic wounds in rats， promote microangiogenesis， reduce tissue damage， and accelerate wound healing.

Key words： high altitude areas; salidroside; rats; chronic wounds; wound healing rate; LDH

青海省深居内陆，最高海拔达6 851 m，最低海拔1 644 m，平均海拔3 000 m以上。青海属于高原大陆性气候，日照时间长、辐射强、缺氧、是导致慢性创面形成的重要外在因素[1]。而深度烧伤、糖尿病足、放射性损伤、压疮等，则是形成慢性创面的主要原因[2]。红景天全株都可入药，其有效单体是红景天苷及和苷元酪醇，在创面愈合、耐缺氧及抗氧化应激等方面有作用[3]。创面修复愈合的过程离不开新鲜肉芽组织及新生血管的生成，CD31作为血管内皮细胞的表达物，促进细胞的黏附运动及血管生成[4]。红景天耐缺氧作用的机制可能是通过不减少血液CO2含量使血液保持正常pH度，减轻氧离曲线左移而减少组织缺氧[5]。乳酸脫氢酶（LDH）是微生物中催化苯丙酮酸生成苯乳酸的一类关键酶，研究表明[6]可能主要是由于剧烈运动、创伤后导致心肌、骨骼肌等组织的细胞膜头痛性上升，从而致使漏出的酶含量上升，进一步使血清酶活性增加。有研究示两个不同海拔地区（青海及河北）的牦牛心肌酶活性、机体代谢功能及抗氧化能力存在一定差异，较高海拔地区的牦牛长期身处低氧环境，逐渐产生高原适应性[7]。本研究选用高海拔地区SD大鼠，制备大鼠创伤性慢性创面，并使用红景天苷进行治疗，观察在高海拔地区创面愈合、微血管的表达及LDH活性检测的变化，并观察红景天苷是否可有效促进创面愈合，初步探讨其相关机制，为高海拔地区慢性创面患者的治疗提供理论依据和实验基础，现报告如下。

1  材料和方法

1.1 实验动物：SPF级健康3月龄SD雄性大鼠75只，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，体重（290±15）g。动物安全使用合格证号：SCXK（湘）2016-0002。实验大鼠均适应性生长7 d后进行实验。该研究经过青海大学附属医院伦理委员会审批，伦理批号：YJ-SJ-20190009。

1.2 主要试剂：苏木素、伊红染色液（武汉赛维尔生物技术有限公司）;CD31兔多克隆抗体（美国Abcam公司）;山羊血清、山羊抗兔工作液、DAB染色剂（北京中杉金桥生物有限公司）。

1.3 主要仪器：脱水包埋机、石蜡切片机（德国莱卡公司）;倒置光学显微镜（日本OLYMPUS公司）;分光光度计（山东奥莱机械有限责任公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模：选取成年雄性健康大鼠75只，数字随机法分为3组，一般创面组、慢性创面组及红景天苷组，每组25只。用电子秤称取75只健康雄性大鼠体重并记录，用碘伏消毒注射部位后按150 mg/kg的盐酸氯胺酮进行腹腔注射麻醉。背部脱毛，用3.0 cm×3.0 cm的卡片在脱毛区用缝合线固定四周标记造模面积，准备一次性无菌切开包及其他物品，待麻醉生效后，用碘伏消毒3遍大鼠背部皮肤备皮处（注意大鼠保暖，减少死亡率），沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，止血，形成大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型[8]。见图1。

1.4.2 一般创面组：造模后，将2 ml生理盐水滴于单层纱布后覆盖于创面。自实验前1 d起，肌注青霉素钾盐（4 000单位/只），连续4 d，以预防感染。创面隔日换药，常规冲洗及包扎。

1.4.3 慢性创面组：造模后，即刻肌肉注射氢化可的松（80 mg/kg），连续注射7 d，2 ml生理盐水滴于单层纱布后覆盖于创面。自实验前1 d起，肌注青霉素钾盐（4 000 单位/只），连续4 d，以预防感染。创面隔日换药，常规冲洗及包扎。

1.4.4 红景天苷组：造模后，即刻肌肉注射氢化可的松（80 mg/kg），连续注射7 d，红景天苷（40 mg）溶于2 ml生理盐水滴于单层纱布后覆盖于创面。自实验前1 d起，肌注青霉素钾盐（4 000单位/只），连续4 d，以预防感染。创面隔日换药，常规冲洗及包扎。

1.5 观察指标

1.5.1 在造模后3、7、14 d取血，每组每个时相点取6只。使用分光光度计检测3组分别在造模3、7、14 d后的乳酸脱氢酶（LDH）活性。分光光度计预热30 min以上，调节波长至450 nm，蒸馏水调零。充分混匀，室温静置3 min，分光光度计（450 nm）下测定吸光度。

1.5.2 HE染色观察第14天创面肉芽组织生长情况，400倍倒置光学显微镜下观察创面新生毛细血管分布情况。

1.5.3 CD31免疫组织化学染色观察第14天CD31表达及微血管计数。CD31阳性染色为棕黄色，在血管内皮细胞胞质中表达，凡被免疫组化染色成棕黄色的圆形、椭圆形定义为一个微血管。每张标本首先在低倍镜下寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，然后在高倍镜下选取3个视野，用医学图像分析软件（Image-pro Plus6.0）计算平均微血管数目。

1.5.4 于造模后第7、14、21、28 d，将大鼠麻醉后观察创面愈合情况。将创面未愈部分在透明胶上按1：1的比例描线，测定创面面积并记录，计算各时间段的创面愈合率。创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

1.6 统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x¯±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，假定方差齐性选择“LSD-t 检验”，未假定方差齐性选择“Tamhane’s T2”，P<0.05 则有统计学意义。

2  结果

2.1 比较三组在不同时间的LDH活性：造模3 d后，红景天苷组的LDH活性低于慢性创面组及一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05）。造模7 d后，红景天苷组的LDH活性低于慢性创面组及一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05）。造模14 d后，红景天苷组的LDH活性低于慢性创面组及一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 比较三组第14天创面肉芽组织生长情况：3组创面比较（见图2），红景天苷组可见大量新生毛细血管，肉芽组织内大量纤维增生，细胞排列较紧密;一般创面组可见少许新生毛细血管，细胞及胶原散在分布;慢性创面组未见明显新生毛细血管，胶原纤维很少，成纤维细胞增生不明显。

2.3 比较三组第14天CD31表达情况和微血管密度：红景天苷组CD31表达整体较一般创面组及慢性创面组广泛且显著，可见大量被染成棕黄色的颗粒，微血管密集（见图3）。三组创面微血管密度值比较，经LSD检验，一般创面组微血管密度高于慢性创面组，差异具有统计学意义（P<0.05）;红景天苷组微血管密度高于一般创面组、慢性创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 比较三组不同时间的创面愈合情况：总结观察结果得出，红景天苷组创面愈合情况最好，皮肤边缘纤维组织增生最少，创面未见明显渗出及炎症反应（见图4、表3）。

2.5 比较三组不同时间的创面愈合率：第7天，一般创面组创面愈合率明显高于慢性创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），红景天苷组与慢性创面组比较，差异具有统计学意义（P>0.05）;第14天，紅景天苷组创面愈合率高于慢性创面组，并高于一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），一般创面组与慢性创面组比较，差异具有统计学意义（P>0.05）;第21天，红景天苷组创面愈合率高于慢性创面组，并高于一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），一般创面组与慢性创面组比较，差异具有统计学意义（P>0.05）;第28天，红景天苷组创面愈合率明显高于慢性创面组及一般创面组，差异具有统计学意义（P<0.05），一般创面组高于慢性创面组，差异具有统计学意义（P>0.05）。见表4。

3  讨论

在高海拔地区，慢性创面的治疗是为了促进创面愈合，提高生活质量，临床上对慢性难愈合创面大多数首选外科手术治疗，常采用自体皮转移、移植以及其他生物材料覆盖以消灭创面，然而这些方法存在增加创伤、引起排异反应等弊端[9]。近年来发现许多中草药对于皮肤的创伤和慢性疾病造成的皮肤溃疡具有独特疗效，中草药中的一些有效成分对创面生长因子的分泌有促进作用[10]。

红景天苷作为祖国中草药可以显著促进皮肤创伤的修复，机制与其促进血管内皮细胞增殖，促使血管增生，改善创伤部位新生肉芽组织血供有关[11]。有研究表明[12]移植红景天苷预处理的ADSCs能够促进糖尿病大鼠皮肤创面的愈合，且创面中CK19、CD31、α-SMA的表达均升高。本实验中，红景天苷组创面第14、21及28天总创面愈合率高于慢性创面组及一般创面组，并且红景天苷组大鼠的微血管密度较他组更高，CD31表达较他组广泛且显著，由此可见，在高海拔地区红景天苷有利于促进慢性创面局部血管新生，改善局部血供情况，加速创面愈合。金雪莲[13]在进行了4种缺氧情况下红景天苷的抗缺氧作用，发现在常压低氧下，红景天苷能很好的延长大鼠生命，在高压缺氧的情况下也有较好的效果，西宁作为高海拔地区，慢性创面患者长期耐受低氧环境，红景天苷能减少细胞氧耗，治疗作用更加明显。红景天苷可逆转氧化低密度脂蛋白诱导的HUVECs损伤，其机制主要表现为细胞活力的上调和乳酸脱氢酶（LDH）释放的下调。红景天甙通过抑制氧化应激和改善线粒体功能紊乱，通过激活AMPK/SIRT 1通路，保护HUVECs免受氧化低密度脂蛋白损伤[14-15]，张勇[16]等报道红景天苷在适当浓度可相应的促进小牛胸主动脉内皮细胞增殖，也能减少内皮细胞中NO、LDH释放，说明红景天苷能促进正常内皮细胞增殖，抑制氧化应激，具有舒张血管的作用。本实验结果显示第3、7、14天红景天苷组LDH较其他两组更低，表明LDH下降可能与红景天苷激活AMPK/SIRT 1通路，抑制氧化应激，减轻组织损伤有关。

本项目研究证实红景天苷能够降低组织损伤，有效促进高海拔地区创伤性慢性创面愈合，为高海拔地区慢性创面的治疗提供了新的思路。此研究将高海拔地区慢性创面的治疗与祖国中医药相结合，符合青海省独特的地理位置及丰富的资源特点，为相关患者的治疗提供一个新的思路及方法。

[参考文献]

[1]安亚南.高原地区慢性难愈性创面的治疗体会[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（69）：368.

[2]王志永，和晓培，薜欣，等.难愈性创面的发生机制及人工真皮在其治疗中的应用进展[J].临床合理用药杂志，2017，10（28）：180-181.

[3]张伟.藏药红景天在临床中的应用[J].中外医疗，2015（1）：96-97.

[4]刘运长.高海拔地区封闭式负压引流技术联合高氧液灌洗治疗糖尿病慢性创面的临床研究[D].西宁：青海大学，2020.

[5]杨来启，吴兴曲，李新田，等.芪参复康胶囊与红景天高原环境应激条件下抗疲劳抗缺氧对照研究[J].中华中医药学刊，2010，28（6）：1170-1172.

[6]高志强，陈广卿，王国庆，等.大鼠运动性骨骼肌损伤后血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶以及波形蛋白的变化[J].中国老年学杂志，2016，36（15）：3634-3636.

[7]雷蕾，包鹏甲，吴晓云，等.不同海拔地区牦牛血液生化指标的比较研究[J].中国畜牧兽医，2018，45（11）：3160-3166.

[8]祁永章，李毅，梁琰，等.肉芽组织下注射微粒皮浆对大鼠创伤性慢性创面愈合的影响[J].中华损伤与修复杂志（电子版），2020，15（6）：475-481.

[9]陈宗建.中药配合封闭创伤负压引流装置治疗慢性难愈合创面56例[J].实用中医药杂志，2015，31（8）：731.

[10]李晓康，王舒，于杨，等.皮肤创伤修复研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2016，15（1）：62-65.

[11]龙世棋，周祝兴，杨黎，等.红景天对皮肤创伤治疗的作用及机制[J].贵州医科大学学报，2016，41（10）：1181-1184.

[12]杨金龙，张荣明，魏巍，等.红景天苷预处理脂肪干细胞促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合的作用及机制[J].实用医学杂志，2021，37（3）：308-313.

[13]金雪莲.红景天苷在不同缺氧状况下抗缺氧作用的实验研究[J].卫生职业教育，2012，30（3）：121-122.

[14]Wu T，Zhou H，Jin Z，et al.Cardioprotection of salidroside from ischemia/reperfusion injury by increasing N-acetylglucosamine linkage to cellular proteins[J].Eur J Pharmacol，2009，613（1-3）：93-99.

[15]Zhu Z， Li J， Zhang X. Salidroside protects against ox-LDL-induced endothelial injury by enhancing autophagy mediated by SIRT1-FoxO1 pathway[J].BMC Complement Altern Med，2019，19（1）：111.

[16]张勇，颜天华，袁林，等.红景天苷对小牛胸主动脉内皮细胞的保护作用[J].药学与临床研究，2009，17（3）：195-199.

[收稿日期]2021-01-11

本文引用格式：祁永章，陈亚莉，王滋兴，等.红景天苷在高海拔地区创伤性慢性创面愈合中的作用及其研究[J].中国美容医学，2022，31（3）：96-99.