冰石长皮软膏拆方对皮肤慢性溃疡大鼠胶原沉淀、炎症因子及VEGF蛋白水平的影响

王蕾 李琰

[摘要]目的：探究冰石長皮软膏拆方对皮肤慢性溃疡大鼠胶原沉淀、炎症因子及VEGF蛋白水平的影响。方法：把实验所用的75只小鼠随机分为5组（n=15），分别为空白组、模型组、原方组、拆方组、西药组，空白组造普通溃疡创面模型，其余4组造慢性溃疡创面模型。空白组和模型组大鼠创面敷生理盐水纱布条，原方组大鼠创面敷冰石长皮软膏原方药膏纱布条，拆方组大鼠创面敷冰石长皮软膏拆方药膏纱布条，西药组大鼠创面敷凡士林油纱布条。观察各组大鼠一般状态，创面面积及愈合率，HE染色比较各组大鼠创面组织形态变化，ELISA检测比较各组大鼠创面血清中炎症因子IL-8和TNF-α的含量，蛋白质印迹及RT-PCR检测各组大鼠组织中VEGF蛋白和mRNA的表达。结果：在造模后，各组大鼠一般情况变差;用药时，大鼠创面颜色变深，肉芽组织相对减少。造模后，创面面积模型组<原方组<拆方组<西药组，但愈合率原方组>拆方组>西药组>模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。和模型组大鼠创面组织病理学比较，西药组、拆方组和原方组大鼠组织的创面和炎细胞浸润逐渐减少，而组织中毛细血管的数量逐渐增多。给药3、7d时，西药组、拆方组和原方组创面炎症因子IL-8和TNF-α的含量均低于模型组（P<0.05），且呈逐渐递减趋势。VEGF蛋白和mRNA结果显示，西药组、拆方组和原方组大鼠创面组织中VEGF蛋白和mRNA表达均显著高于模型组（P<0.05），且呈逐渐递增趋势。结论：冰石长皮软膏拆方可有效增加慢性皮肤溃疡胶原沉淀，促进创面愈合，减轻创面组织中炎症因子的含量及促进血管内皮生长因子VEGF的表达。

[关键词]冰石长皮软膏拆方;皮肤;慢性溃疡;胶原沉淀;创面愈合;炎症因子;VEGF

[中图分类号]R632.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）03-0090-06

Effects of Bingshi Changpi Ointment on Collagen Deposition，Inflammatory Factors and Vegf Protein Levels in Rats with Chronic Skin Ulcer

WANG Lei，LI Yan

（Department of Traditional Chinese Medicine， the Ninth People's Hospital Affiliated to the Medical College of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200125，China）

Abstract： Objective To explore the effects of Bingshi Changpi ointment on collagen precipitation， inflammatory factors and VEGF protein levels in rats with chronic skin ulcer. Methods The 75 mice used in the experiment were randomly divided into 5 groups （n=15），which were blank group， model group， original formula group， disassembled formula group and Western medicine group. The blank group made ordinary ulcer wound model， and the other 4 groups made chronic ulcer wound model. Rats in the blank group and the model group were applied with normal saline gauze strips， rats in the original formula group were applied with Bingshi Changpi ointment， rats in the simplified group were applied with Bingshi Changpi ointment， rats in the western medicine group were applied with vaseline oil gauze strips. The general state， wound area and healing rate of rats in each group were observed. The morphological changes of wound tissue in each group were compared by HE staining， and the inflammatory factors IL-8 and TNF in wound serum of rats in each group were detected by ELISA-α The expression of VEGF protein and mRNA in rat tissues was detected by Western blot and RT-PCR. Results After modeling， the general condition of the rats in each group became worse; when the drug was administered， the color of the wound surface of the rats became darker， and the granulation tissue was relatively reduced. After modeling， the wound area model group < original recipe group < disassembled recipe group < western medicine group， but the healing rate of the original recipe group > disassembled recipe group > western medicine group > model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the histopathology of the wounds of the rats in the model group， the wounds and inflammatory cell infiltration in the tissues of the western medicine group， the disassembled prescription group and the original prescription group gradually decreased， while the number of capillaries in the tissues gradually increased. On the 3rd and 7th day of administration， the contents of inflammatory factors IL-8 and TNF-α in the wounds of the western medicine group， the disassembled prescription group and the original prescription group were lower than those of the model group （P<0.05）， and showed a gradually decreasing trend. The results of VEGF protein and mRNA showed that the expressions of VEGF protein and mRNA in the wound tissue of the western medicine group， the split prescription group and the original prescription group were significantly higher than those of the model group （P<0.05）， and showed a gradual increasing trend. Conclusion Bingshi Changpi ointment can effectively increase collagen deposition in chronic skin ulcer， promote wound healing， reduce the content of inflammatory factors and promote the expression of vascular endothelial growth factor VEGF.

Key words： Bingshi Changpi ointment; skin; chronic ulcer; collagen deposition; wound healing; inflammatory factors; VEGF

皮肤溃疡是指2周以上创面未愈合的皮肤软组织缺损，手术刀口、意外创伤等多种原因都会引发皮肤溃疡的发生，其不仅是临床上较难治愈的疾病之一，也是修复创面的难题之一[1]。慢性皮肤溃疡是一种常见的皮肤溃疡，具有发病率高、病程长、易反复等特点，极大地影响患者的生活质量。目前，临床上通常采用保护剂、抗生素、微量元素等局部治疗法治疗皮肤溃疡，但治疗后的创面一直处于自然愈合阶段，这在一定程度上限制了创面的愈合[2]。某些生长因子可促进细胞增殖以及创面愈合，不过创面愈合需多种生长因子共同作用，这一过程中引起的细胞过度增殖又会引发创面形成增殖性瘢痕甚至是癌变，故其安全性备受人们的关注。研究发现血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生过程中发挥着重要的作用，而血管生成与慢性溃疡性疾病密切相关[3-4]。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白介素8（Interleukin-8，IL-8）是炎症反应的重要因子，因此慢性皮肤溃疡引起的慢性炎症有致癌风险[5]。中医学有着丰富的修复创面和治疗慢性溃疡疾病的临床经验[6]。冰石长皮膏是上海交通大学附属第九人民医院的传统制剂，经过近40年的临床实践，对治疗难愈性皮肤溃疡可以明显促进创面肉芽组织生长，加速创面愈合，缩短治疗周期，效果确实可靠，但其具体作用机制尚不明确[7]，因此本文建立慢性皮肤溃疡大鼠模型，观察冰石长皮软膏拆方对大鼠皮肤创面愈合情况、炎症因子和VEGF蛋白表达。

1  材料和方法

1.1 动物：75只雄性SD大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2006-0009]。大鼠质量为180～220 g，清洁级，所有大鼠均饲养在清洁的动物房内，保持室内温度为20℃～24℃，相对湿度为40%，光照12 h一循环，昼夜交替。

1.2 药物：冰石长皮软膏、冰石长皮软膏拆方、凡士林（上海交通大学医药院附属第九人民医院制剂室提供）。冰石长皮软膏由101 g煅石膏、101 g煅硼砂、3 g冰片、30 g升丹、30 g象皮组成;冰石长皮软膏拆方（去升丹和象皮）由101 g煅石膏、101 g煅硼砂、3 g冰片组成。将各组方涂抹在纱布上制成厚度为3 mm的药膏纱布。

1.3 试剂和仪器：一次性无菌敷料贴（山东东华医疗科技有限公司，批号：20130187）;注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司生产，批号：Y051122）;HE染色液（北京中杉金桥公司，批号：ZLI-9610）;VEGF抗体（天津瑞博星科技有限公司）;超纯RNA提取试剂盒（美国AppliedBiosystems公司，批号：Cat#CW0581）;EG1140C包埋机、RM2135石蜡切片机（德国Leica公司）;EOSM3数码相机（日本佳能公司）。

1.4 动物分组：把75只小鼠随机分5组，分别为空白组、模型组、原方组、拆方组和西药组，每组15只。

1.5 模型制备：在实验前1 d用脱毛膏将大鼠背部皮肤脱毛，实验当天2.5%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉大鼠，如图1所示在背部脊柱两侧制作6个1.5 cm2的全层皮肤缺损溃疡创面。除空白组外的其余4组大鼠在筋膜下喷洒金黄色葡萄球菌，并用3层纱布覆盖创面部位，用橡皮膏包扎创面并固定，各组大鼠均肌肉注射氢化可的松3.75 mg/kg。当观察到各组大鼠的体重及溃疡的面积没有明显的差异时开始给药干预。

1.6 给药：治疗时將含不同药物的纱布条敷在各组大鼠的创面上，空白组和模型组大鼠在创面均覆盖生理盐水纱布条治疗;原方组大鼠在创面覆盖冰石长皮软膏原方药膏纱布条治疗;拆方组大鼠在疮创面覆盖冰石长皮软膏拆方药膏纱布条治疗;西药组大鼠在创面覆盖凡士林油纱布条治疗，用医用纱布和橡皮膏将创面固定，纱布1天更换1次，直至所有创面愈合。

1.7 检测指标与方法：各组大鼠在造模3 d和7 d后，随机取出5只大鼠并抽取腹主动脉血，用于指标检测。在造模3、7、14 d时，各组随机取出4只大鼠并处死，取各组大鼠伤口组织，石蜡包埋后切片，用于HE染色和RT-PCR检测。

1.7.1 一般指标：造模成功后，每天观察各组大鼠的饮食、排便、活动及大鼠体重的变化，并记录。

1.7.2 皮肤创面面积及愈合率：造模3、7、14 d时，用透明膜覆盖创面。记号笔画膜，再将透明膜覆盖在心电图纸上计算创面面积。按下列公式计算创面愈合率：愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

1.7.3 皮肤创面组织学观察：造模3、7、14 d时，随机取各组大鼠4只，处死后取皮肤创面组织，用福尔马林将组织固定48 h后，经脱水、透明、石蜡包埋、切片处理;用HE染色后在显微镜下观察各组创面组织的变化情况。

1.7.4 ELISA检测TNF-α和IL-8含量：各组大鼠在给药3、7 d时麻醉大鼠，取各组大鼠腹主动脉血，将血液静置30 min后离心处理，15 min后收集上清液，将其装置于EP管中，用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-8、TNF-α的含量，实验操作均按照试剂盒说明书严格进行。

1.7.5 蛋白质印迹检测大鼠皮肤创面肉芽组织VEGF蛋白表达：于造模14 d时，取创面组织50 mg进行12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转膜。转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T中清洗3次，每次3 min。封闭：配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，置于4℃过夜。结合一抗：用封闭液将一抗1：400稀释，与膜一起孵育3 h，室温振荡。洗膜：TBS-T溶液中清洗3次，每次5 min。结合二抗：用封闭液将二抗1：3 000稀释，与膜共同孵育1.5 h，洗膜同上。暗室中在膜上滴加ECL，经适当显色后，用保鲜膜将膜包好，将膜放入暗盒中，上置医用X光胶片，暴光适当时间，经显影，定影，室温下晾干。图像扫描，灰度分析。实验重复3次。以VEGF与β-actin的光密度比值表示VEGF蛋白的表达。应用图像分析软件Image J进行光密度半定量蛋白质检测。

1.7.6 RT-PCR检测大鼠皮肤创面肉芽组织VEGF mRNA的表达：分别取各组大鼠皮肤创面组织，PBS将组织清洗后提取总的RNA。按照42℃ 60 min、72℃ 5 min的反应条件逆转录合成cDNA，按照试剂盒说明书进行PCR反应。扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，40个循环。运用2-△△Ct法计算基因相对表达量。VEGF引物序列：正向引物为5'-CTCGCAGTCCGAGCCGGAGA-3'，反向引物为5'-GCAGCCTGGGACCACTTGGC-3';β-actin引物序列：正向引物5'-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3'，反向引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3'。

1.8 统计学分析：采用SPSS17.0统计学软件对各组大鼠创面面积、愈合率、血清中TNF-α和IL-8含量，创面组织病理学变化及VEGF蛋白和mRNA的表达进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x¯±s）表示，采用t检验两组间的数据比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠一般情况变化比较：在造模过程中，原方组死亡1只大鼠，拆方组死亡1只大鼠;在造模后，各组大鼠饮食减少，排便变稀，体重逐渐下降，出现蜷缩且活动减少的现象，创面组织有腥臭味的分泌物，2 d后发现大鼠的分泌物减少且变稀;用药时，大鼠的创面颜色变深，肉芽组织相对减少。

2.2 各组大鼠创面面积及愈合率比较：造模3 d时，各组大鼠皮肤创面面积及愈合率没有明显的差异（P>0.05）;造模7、14 d时，各组创面面积逐渐下降，愈合率逐渐上升，其中模型组大鼠创面面积最高，皮肤愈合率最低，符合慢性皮肤溃疡创面愈合迟缓的表现;原方组创面面积<拆方组创面面积<西药组创面面积，且原方组愈合率>拆方组愈合率>西药组愈合率（P<0.05），见表1。

2.3 各组大鼠创面组织学变化比较：各组大鼠创面组织学病理情况见表2，图2。

2.4 各组大鼠炎症因子TNF-α和IL-8含量比较：给药3、7 d时，空白组、模型组、西药组、拆方组和原方组大鼠创面血清中炎症因子IL-8和TNF-α的含量比较，差异有统计学意义（P<0.05），和空白组相比，模型组炎症因子IL-8和TNF-α含量显著增加，西药组、拆方组和原方组炎症因子含量均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.5 各组大鼠造模14 d时创面组织中VEGF蛋白表达比较：空白组、模型组、西药组、拆方组和原方组大鼠创面组织中VEGF蛋白表达，差异有统计学意义（P<0.05）;和空白组相比，模型组大鼠创面组织中VEGF蛋白表达显著降低（P<0.05）;西药组、拆方组和原方组大鼠创面组织中VEGF蛋白表达均显著高于模型组，且呈递增趋势，差异有统计学意义（P<0.05），见图3～4。

2.6 各组大鼠创面肉芽组织中VEGF mRNA表达比较：空白组、模型组、西药组、拆方组和原方组大鼠创面组织中VEGF mRNA表达分别为1.98±0.23、0.36±0.12、0.76±0.19、1.02±0.31、1.53±0.29，五組间比较差异有统计学意义（P<0.05）;和空白组相比，模型组大鼠创面组织中VEGF mRNA表达显著降低（P<0.05）;西药组、拆方组、原方组VEGF mRNA表达均高于模型组，呈递增趋势，差异均有统计学意义（P<0.05），见图5。

3  讨论

慢性皮肤溃疡是外科中难治疾病之一，主要是由于于创面局部微环境的异常变化导致创面难以修复[8]。目前临床上常采用清创、换药、植皮等方法治疗创面，但治疗的效果还不是十分的理想。有研究发现，巨噬细胞是导致慢性皮肤溃疡炎症持续存在的主导因素[9]。研究证实，创面愈合程度从炎症转为修复所必须经过的过程主要为巨噬细胞的变化，其会由炎性表型过渡到修复性表型[10-11]。当慢性难以愈合创面中巨噬细胞表型的转化功能出现时，会阻止其抗炎症的功效，难以发挥修复功能，所以巨噬细胞表型转发发生异常会让创面的炎症一直存在，迟缓了创面的愈合。在中医中，慢性皮肤溃疡属于“疮疡”的范畴，其属首辨阴阳，其中在慢性难愈合性皮肤溃疡中最常见的证行为阴疮，也是导致创面愈合的主要障碍[12]。目前，中医学对溃疡治疗有着悠久的历史和良好的疗效，中药药膏外敷方法简单，疗效确切，副作用小，一直广泛应用于临床。冰石长皮膏由煅石膏、冰片、象皮粉、升丹、硼砂组成，诸药解毒祛腐活血化瘀，生肌敛疮，奏效迅速。郭仲华等[13]提出皮肤溃疡创面的愈合规律是“腐去肌生”和“肌平皮长”。“煨脓长肉”是中医传统的疗疮愈伤的法则。

本研究结果显示，皮肤缺损溃疡大鼠创面组织有大量的炎性细胞浸润，西药组、拆方组和原方组均增加成纤维细胞和毛细血管数量，减少炎性细胞浸润。创面愈合面积和愈合率结果显示，各个给药组大鼠的创面愈合率也明显增加，大鼠创面的愈合时间和面积也得到了减少;创面组织中出现的炎症反应，开启了愈合的程序，让炎症发展为增殖期，新生大量的胶原，进而形成肉芽组织，表明西药组、拆方组和原方组均可促进大鼠慢性溃疡的创面愈合。冰石长皮膏在传统的中药生肌散的基础上研制，半个世纪以来成功治愈各种慢性溃疡不逾万例，蒉纲[14]等研究发现，长皮膏结合中药离子可有效减轻指端伤残伤口的肿胀及疼痛，明显缩短患指创面愈合时间。

肉芽组织形成是所有创伤修复的关键，直接影响创伤愈合程度及其预后，其本质是大量的毛细血管和成纤维细胞形成，其中毛细血管再生及血管网形成均起重要作用[15]。VEGF是目前发现唯一作用于血管内皮细胞的生长因子，在血管新生中起到关键作用[16]。很多研究已经证实VEGF可以促进血管的新生，从而促进溃疡愈合。同时，有研究表明，慢性皮肤溃疡的发病与炎症刺激相关[17]。有研究表明，炎症因子 TNF-α及IL-8含量过高不仅可以导致溃疡组织炎症反应，还会抑制创面的愈合，而降低炎症因子的水平则可以促进溃疡的愈合[18]。本研究结果显示，药物干预后的西药组、拆方组和原方组大鼠创面组织中的炎症因子TNF-α和IL-8均少于模型组，且组织中的VEGF蛋白表达均高于模型组，且炎症因子呈递减趋势，VEGF表达呈递增趋势，可见在皮肤慢性溃疡发生时出现大量的炎症因子，且VEGF表达减少，冰石长皮软膏和冰石长皮软膏拆方均可抑制创面炎症因子的含量，且有效增加血管内皮细胞生长因子VEGF的表达。羊羡等[19]研究发现，在慢性皮肤溃疡创面组织中炎症因子TNF-α、IL-6含量显著升高，VEGF表达显著降低。冰石长皮软膏由煅石膏、硼砂、冰片、象皮粉、升丹组成，功效“清热解毒，祛腐生肌”，方中冰片芳香清热止痛，能辟一切邪恶，又能引诸药入窍，硼砂、升丹祛腐解毒，煅石膏、象皮粉清热敛疮。近年来，受制于野生保护动物（象皮）和重金属毒性（升丹），造成药物时难接续，对长皮膏药物应用推广及科室发展造成较大影响。因此本研究证实，保留原方功效的前提下，依照增效减毒的原则，精简拆方也可以起到有效的作用。廖明娟[20]等通过对观察冰石长皮膏对大鼠慢性难愈合创面的疗效观察  发现，冰石长皮膏能明显促进大鼠慢性难愈性创面愈合，缩短愈合时间。

综上所述，冰石长皮软膏拆方可有效增加慢性皮肤溃疡胶原沉淀，促进创面愈合，减轻创面组织中炎症因子的含量及促进血管内皮生长因子VEGF的表达。

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[收稿日期]2021-09-14

本文引用格式：王蕾，李琰.冰石长皮软膏拆方对皮肤慢性溃疡大鼠胶原沉淀、炎症因子及VEGF蛋白水平的影响[J].中国美容医学，2022，31（3）：90-95.