HPLC-MS/MS 法测定化妆品中克霉唑含量的不确定度评定

蒋凤兵

目前, 各式各样功能各异的化妆品业已成为人们生活中必不可少的消费品。 随着行业需求和消费的日益激增, 化妆品使用的安全问题也越来越突出[1]。 不少不法厂商在化妆品中超量添加限用物质或者非法添加某些有害禁用物质, 以期达到某种功能上的特效, 吸引更多消费者, 获取更多的不法收益。 例如: 向化妆品中添加糖皮质激素、 抗生素、 重金属等等[2-3]。这不仅侵害了消费者合法权益, 也严重危害到化妆品的行业发展。 化妆品中非法添加物质的检测工作一直在化妆品安全监管中发挥着重要的作用。

由于仪器设备、 环境变化以及人员操作等因素的影响, 会给化妆品的定量检验工作引入一定的不确定度[4-9]。 科学的、完整的对实验过程中的各环节各影响因素进行不确定度评定,将增加检验数据的完整性、 科学性与可比性。 本文按照《测量不确定度评定与表示》JJF 1059.1-2012[10]和《常用玻璃量器检定规程》JJG 196-2006[11]的要求, 评定了《化妆品安全技术规范》(2015 年版)[12]中高效液相质谱法检验化妆品克霉唑含量的不确定度。 为实验室做精做细检验检测及质量控制提供依据,同时为检测化妆品中其他抗感染类药物含量的不确定度评定提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器和材料

1.1.1 仪 器

Thermo Fisher Scientific Vanquish 超高效液相色谱仪;Thermo Fisher Scientific TSQ Endura 三重四级杆质谱仪; 涡旋震荡器, 江苏康健; AllegraX-30R 冷冻离心机, 贝克曼; XPE204万分之一天平, 梅特勒-托利多; MSA225S-1CE-D1 十万分之一天平, 赛多利斯; KQ-800KDE 超声提取仪, 昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2 材料与试剂

标准品: 克霉唑(Clotrimazole, 中国食品药品检定研究院,批号: 100037-202008, 含量: 99.5%); 试剂: 乙腈和甲酸(Thermo Fisher Scientific, 分析纯); 样品: 日常监督阳性样品。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件

色谱柱: Thermo Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm 1.9 μm),柱温: 40 ℃; 流动相: 含0.1%甲酸乙腈(A), 含0.1%甲酸水(B)。 梯度洗脱(0.0 ～2.0 min, 20%A; 2.0 ～4.0 min, 20%A→90%A; 4.0 ～6.0 min, 90%A; 6.0 ～6.2 min, 90%A→20%A; 6.2 ～8.0 min, 20%A)。 流速为0.3 mL/min, 进样量为2.0 μL。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾源(ESI), 喷雾电压为3500 V, 鞘气流速为35 Arb, 辅助气流速为10 Arb, 尾吹气流速为1 Arb, 离子传输管温度为350 ℃, 雾化器温度为350 ℃。 采用正离子模式,多级反应监测(MRM)。 质谱参数见表1。

表1 质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters

1.3 溶液的配制

1.3.1 标准品溶液的配制

准确称取克霉唑标准品约10 mg, 至50 mL 容量瓶中, 加甲醇适量, 超声溶解, 放凉, 加甲醇并定容至刻度, 作为标准品储备液。 准确吸取标准品储备液1.0 mL, 至100 mL 容量瓶中, 加甲醇稀释并定容至刻度, 摇匀, 作为标准品工作储备溶液。 准确吸量取标准品工作储备溶液0.1、 0.2、 0.4、 0.5、1.0 mL, 至10 mL 容量瓶中, 加入甲醇稀释并定容至刻度, 得S1、 S2、 S3、 S4、 S5 标准系列溶液。

1.3.2 样品溶液的配制

称取样品约0.2 g, 置于10 mL 容量瓶中, 加入饱和氯化钠溶液1 mL, 在涡旋震荡器上涡旋30 s。 加入5 mL 乙腈, 涡旋30 s, 超声提取30 min。 静置至室温, 用乙腈定容至刻度, 摇匀, 以4500 r/min 离心10 min, 取上清液0.22 μm 滤膜过滤,滤液作为样品溶液。

2 测定模型

标准系列溶液和样品溶液分别注入高效液相串联质谱联用仪法测定。 以标准系列溶液中克霉唑的含量为横坐标, 以峰面积为纵坐标, 拟合标准曲线, 并计算样品溶液中克霉唑的质量浓度。 并按照式(1)计算化妆品中克霉唑的含量:

式中:ω为化妆品中克霉唑的质量分数, μg/g;ρ为样品溶液中克霉唑的质量浓度, μg/mL;V为样品定容体积, mL;m为样品取样量, g。

3 测量不确定度来源

综合分析实验过程, 测量结果的不确定度主要来自以下几个方面: (1)标准品引入的不确定度urel(1); (2)样品引入的不确定度urel(2); (3)仪器引入的不确定度urel(3); (4)测量重复性引入的不确定度urel(4)。 化妆品中克霉唑测量的不确定度按式(2)合成。

4 不确定度评定及合成

4.1 标准品引入的不确定度

4.1.1 标准品纯度引入的不确定度

证书上查得克霉唑标准品纯度为99.5%, 服从矩形分布,包含因子由标准品纯度引入的标准不确定度则为相对标准不确定度则为ur,1(P)=

4.1.2 标准品称量引入的不确定度

由天平计量证书可知, 该天平的偏载误差为±0.03 mg。偏载误差不确定度服从矩形分步, 包含因子由标准品的称量引入的标准不确定度克霉唑标准品称量约10 mg, 则标准品称量引入的相对标准不确定度

4.1.3 标准品储备液定容引入的不确定度

(1)定容体积引入的不确定度

克霉唑标准品称取置50 mL 容量瓶中溶解定容。 JJG 196-2006 中规定, 在20 ℃时50 mL 的A 级容量瓶的容量误差为±0.05 mL, 不确定度服从三角分布,则由标准品储备液定容体积引入的标准不确定度其相对标准不确定度

(2)温度引入的确定度

在20 ℃时, 玻璃仪器和甲醇体积膨胀系数a1、 a2分别为2.5×10-5、 1.19×10-3。 实验在23 ℃条件下进行, 由温度引起的体积变化ΔV=(a2-a1)×50×ΔT=0.17475 mL, 体积不确定度服从三角分布,则使用50 mL A 级容量瓶时, 温度引入的标准不确定度其相对标准不确定度

则标准储备液定容引入的相对标准不确定度ur,1(V)=

4.1.4 储备液稀释过程引入的不确定度

精密量取标准品储备液1.0 mL, 至100 mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 作为标准品工作储备溶液。 按照矩形分布处理, 玻璃器皿及温度波动引入的不确定度见表2。

表2 储备液稀释过程引入的不确定度Table 2 Uncertainties arising from stock solution dilution

则储备液稀释过程引入的不确定度为:

4.1.5 系列标准工作溶液的稀释引入的不确定度

(1)移液体积引入的不确定度

系列标准工作溶液的稀释过程中使用了200 μL 和1000 μL移液器。 由移液器校准证书可知, 200 μL 和1000 μL 移液器的标准不确定度分别为0.25 和0.20。 系列标准溶液各浓度点溶液移液体积引入不确定度见表3。 则移液体积引入的相对标准不确定度为

表3 系列标准溶液配制过程中移液体积引入不确定度Table 3 Uncertainty introduced by pipetting volume during preparation of series standard solutions

(2)温差引入的不确定度

按4.1.3(3)项下同法评定, 由使用温度和校准温度不同引入的相对标准不确定度ur,1(d2)=0.001427。 则合成系列标准工作溶液的稀释引入的相对标准不确定度为ur,1(d) =

4.1.6 标准曲线拟合引入的不确定度

不同浓度水平的标准溶液, 分别测定2 次, 得到相应的响应值, 最小二乘法进行拟合, 得到直线方程和相关系数为y=13003X+28125, r=0.9993, 具体数据情况见表4。

表4 标准系列溶液测定值和计算结果Table 4 Measured values and calculation results of standard series solutions

根据贝塞尔公式计算标准曲线的剩余标准差:

对同一样品溶液进行了4 次测定, 平均浓度为93.2059 ng/mL。根据标准曲线拟合带来的不确定度计算公式进行计算, 本次实验的标准曲线不确定度为:

式中, n 为标准系列溶液的测量点数, n=10; p 为待测样品的重复测定数, p=4;为标准系列溶液的平均浓度值,c=108.9246 ng/mL, x 为测试样品的浓度平均值, x=93.2059 ng/mL; Ci为标准曲线各点的浓度值; b 为拟合曲线的斜率。

标准曲线拟合带来的相对不确定度为:

则由标准品引入的相对不确定度为:

4.2 样品引入的不确定度

4.2.1 由样品称样引入的不确定度

取样本次实验称量准确至0.0001 g, 使用天平为计量检定合格, 该准确级别天平的最大允差为±0.0005 g, 按天平引起的不确定度呈均匀分布, 则称样量为0.2 g, 则天平引起的相对标准不确定度为:

4.2.2 由样品溶液定容引入的不确定度

(1)容量允差引入的不确定度

20 ℃, 10 mL A 级容量瓶的容量允差为±0.020 mL, 取均匀分布, 则试液定容时引入的标准不确定度为:则其相对标准不确定度为:

(2)温度引入的不确定度

玻璃仪器和乙腈在20 ℃时体积膨胀系数a1、 a2分别为2.5×10-5、 1.37×10-3。 实验温度为23 ℃时, 使用10 mL A 级容量瓶, 由温度差引起的体积变化ΔV=(a2-a1)×10×ΔT=0.04035 mL,体积不确定度服从三角分布,则使用10 mL A 级容量瓶时, 温度引入的标准不确定度其相对标准不确定度则由样品溶液定容引入的不确定度为:

综上, 样品引入的相对标准不确定度为urel(2) =

4.3 仪器引入的不确定度

查仪器校准证书可知高效液相色谱-串联质谱仪重复性相对相对标准偏差为2%,k=2, 其相对标准不确定度0.01。

4.4 测量重复性引入的不确定度

本次实验在重复性条件下对每个样品中克霉唑进行了6 次测定, 结果分别为9.1416 μg/g、 9.3594 μg/g、 9.1492 μg/g、9.2377 μg/g、 9.4070 μg/g、 9.3707 μg/g。

单次测量的标准不确定度为:

算术平均值的标准不确定度为:

因此, 克霉唑含量的算术平均值的相对标准不确定度为:

将上述各环节引入不确定度代入式(1), 计算得出本次实验克霉唑的合成相对标准不确定度为:

5 扩展不确定度及结果表示

实验所得样品中克霉唑含量平均为9.2562 μg/g, 其标准不确定度u(ω)=urel(ω)×ω=0.2314 μg/g, 依据JJF 1059.1-2012,取k=2(p=95%), 扩展不确定度U=k×u(ω)=0.4628 μg/g。 则样品中克霉唑的质量分数ω=9.2562±0.4628 μg/g,k=2。