马钱子总碱脂质液晶纳米粒的制备及工艺优化*

喻龙江, 王晓慧, 刘婉婷, 谢 骥, 李海平

马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nμx ～vomica Linn. )的干燥成熟种子, 马钱子性味苦, 性温, 归肝、 脾经, 有大毒,有散结消肿、 通络止痛之功效[1], 马钱子主要有效成分为生物碱, 马钱子总碱(马钱子碱和士的宁)占总生物碱的85 %以上[2-3]。 研究发现, 马钱子碱不仅能增加吗啡的镇痛作用, 还能延长其镇痛时间[4], (因士的宁镇痛较弱且毒性较强没有进行考察)无成瘾性。 因安全范围窄小, 《中国药典》收载的剂型甚少, 影响了其在临床上的使用。 以脂质体为载体的药物以其独特的靶向性、 缓释性受到研究者的关注[5-6]。

硫酸铵梯度主动载药技术利用药物对硫酸铵电离形式的依耐性, 以电中性形式跨越脂质双层, 而非电离形式, 通过形成脂质体膜内、 外水相pH 值差异, 促使外水相药物自发向脂质体内部聚集, 从而获得较高的药物包封率[7]。 本研究考察硫酸铵梯度主动载药技术制备马钱子脂质体的可行性, 为其外用纳米经皮制剂开发提供理论参考。

1 仪器和试药

1.1 仪 器

Agilent 1220 Serie 高效液相色谱仪, 美国安捷伦公司; RE-52 旋转蒸发仪, 上海亚荣生化; Zetasizer Nano ZSP 纳米粒度电位仪, 英国马尔文; FEI 透射电子显微镜(美国); HL-2S 恒流泵, 上海沪西分析仪器厂有限公司; PHS-3C 型pH 计, 上海精科; LF-1 脂质体挤出仪, Avestin 公司; FA25 型高速剪切机, FLUKO 公司。

1.2 试 药

马钱子总碱粉末(自制, 其中马钱子总生物碱占85.06%,含马钱子碱约为21.87%); 马钱子碱对照品(中国生物制品检定所, 编号110705); 大豆卵磷脂、 胆固醇(分析纯), 中国慧兴生化试剂有限公司; Sephadex G-50, Pharm a-cia 公司; 其他试剂均为分析纯或色谱纯, 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 马钱子总碱脂质体的制备

精密称取处方量的卵磷脂、 胆固醇(质量比6 ∶1)溶于14 mL 无水乙醇中, 超声至完全溶解, 以5 mL/min 速度注入磁力搅拌中预热的硫酸铵溶液(浓度0.2 mol/mL)中, 60 ℃水浴减压旋蒸除去乙醇, 孵化15 min, 用20 倍pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析除去外水相硫酸铵, 高速剪切2 遍, 每遍1 min, 脂质体挤出仪挤出, 冷却至室温, 制得空白脂质体。 取空白脂质体加入等量2.0 mg/mL 马钱子碱PBS 溶液, 60 ℃水浴恒温磁力搅拌3 min, 即得LLSN。

2.2 马钱子碱的含量测定方法

2.2.1 标准曲线的绘制

称取马钱子碱标准品20 mg, 置100 mL 容量瓶中, 加甲醇溶解后稀释至刻度, 得到浓度为200 μg/mL 标准品储备液。 精密吸取标准品储备液0.5、 1、 2、 3 和4 mL 于10 mL 容量瓶中,用定容至刻度, 得到浓度为10 ～80 μg/mL 的梯度标准溶液。用甲醇溶液作为参比, 262 nm 波长测定吸光度A。 以吸光度A为纵坐标, 浓度C 为横坐标, 绘制标准曲线, 见图1, 回归方程为A=0.0002C+0.0046, R2= 0.9993。

图1 马钱子碱标准曲线Fig.1 Standard curve of strychnine

图1 显示, 马钱子碱标准溶液浓度在10 ～80 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度实验

分别取一定浓度对照品溶液, 连续测定6 次, 记录吸光度A, 结果RSD(n=6)为0.47%, 方法精密度良好。

2.2.3 稳定性实验分别在第0、 2、 4、 8 、 12、 24 h 分别测定同一供试品溶液,记录吸光度A, 结果RSD(n=6)为0.89%, 方法稳定性良好。

2.2.4 重复性试验

取同一批供试品6 份, 连续测定6 次, 记录吸光度A,RSD 值(n=6)为0.43%, 方法的重复性良好。

2.2.5 加样回收实验

在含有20.21 μg 的供试液中, 按照50%、 100%、 150%的比例(低、 中、 高)加入相应量的标准溶液, 测定吸光度A,计算含量。 实验结果见表1。

表1 加样回收率结果(n=3)Table 1 Recovery rate (n=3)

表1 结果显示, 平均回收率为100.16%、 RSD 为0.38%,方法稳定性好、 准确度高。

2.3 马钱子碱包封率的测定

采用葡聚糖凝胶柱法[7]。

2.3.1 脂质体洗脱曲线的绘制

取脂质体适量, 分别用PBS 和破膜剂(异丙醇∶无水乙醇=4 ∶1)经Sephadex G-50 柱进行恒速洗脱, 流速2 mL/min, 每次2 mL, 共15 次, 以PBS 和破膜剂等量混合为参比, 262 nm处测定吸光度A, 绘制洗脱曲线, 见图2。

图2 脂质体洗脱曲线Fig.2 Elution curve of total base nanoliposomes from strychnine

2.3.2 脂质液晶纳米粒包封率测定

依据洗脱曲线分别收集前10 mL 含药脂质体洗脱液和后18 mL 游离药物的洗脱液进行含量测定, 计算脂质体中包封药物含量和游离药物含量, 计算包封率(1)。

包封率=[脂质体中药物含量/(脂质体中药物含量+游离药物含量]×100% (1)

2.4 马钱子碱纳米脂质体制备方法的筛选

分别选用逆向蒸发法、 薄膜分散法、 乙醇注入-硫酸铵梯度法等3 种方法制备马钱子碱脂质体, 结果见表2。

表2 不同制备方法包封率和成形性结果Table 2 Encapsulation efficiency and formability results of different preparation methods

表2 结果显示, 乙醇注入-硫酸铵梯度法明显优于其他两种方法, 可以作为优选制备方法。

2.5 正交设计优化LLCN 制备工艺

2.5.1 单因素分析

初步选定四个影响因素(A、 B、 C、 D)四水平进行单因素分析, 确定因素的响应值。 因素-水平表见表3, 各因素对马钱子碱包封率的影响, 实验结果见图3。

表3 因素-水平表(单因素分析)Table 3 Factors-level table (single factor analysis)

图3 各因素对包封率的影响结果Fig.3 Influence of various factors on encapsulation rate

图3 结果显示, 单因素分析预测各因素最优相应点为(A)磷脂-胆固醇比6 ∶1、 (B)药-脂比为10 ∶1、 (C)乙醇的体积12 mL/100 g、 (D)方差项。

2.5.2 正交设计优化处方因素

因素与水平表见表4, 实验结果见表5, 方差分析见表6。

表4 因素与水平L9(34)表(正交设计实验)Table 4 Factors and level L9(34) table(orthogonal design experiment)

表5 正交设计实验结果Table 5 Experimental results of central composite response surface design

表6 正交实验方差分析结果Table 6 Results of variance analysis of orthogonal experiment

通过直观分析最优处方方案为A2B2C3, 其主次影响因素的顺序为C＞A＞B; 正交设计结果与直观分析相符, 主体间效应检验差异显著(P＜0.05 或P＜0.01)。 磷脂∶胆固醇比为6 ∶1、脂-药比为10 ∶1、 乙醇的体积为12 mL/100 g 时为最优方案。

2.5.3 验证性实验

按照A2B2C3方案, 平行制备3 份, 包封率结果见表7。

表7 验证性实验结果(n=3)Table 7 Confirmatory experimental results(n=3)

表7 显示, 正交设计优化的提取工艺稳定可靠, 质量可控。

2.6 脂质体粒径测定和表征观察

采用Zeta 电位粒度测定仪, 超纯水为分散介质测定马钱子总碱脂质体的平均粒径为156±10.21 nm, 见图5。 用透射电子显微镜观察并拍摄照片, 马钱子总碱脂质体的扫描电镜图见图6。 马钱子总碱脂质体成球形, 形态完整, 分界明显。

图5 脂质体粒径分布图Fig.5 Size distribution of liposomes

图6 脂质体扫描电镜图Fig.6 Scanning electron microscopy of liposomes

3 结 论

(1)硫酸铵梯度法是利用硫酸铵溶液为水相, 制备内外均含有硫酸铵的脂质体, 然后洗掉外相的硫酸铵, 从而形成脂质体内外硫酸铵的浓度梯度。 硫酸铵溶液水解后, 在内水相中,易分解成NH3+H+, 这是产生pH 动力的主要原因, 不同离子对双分子层渗透性能的贡献有如下规律, 即(NH4)2SO4＜而NH3不断地从脂质体内相的离去, 导致内外相H+的浓度梯度。 马钱子碱为弱碱性药物, 进入内水相后, 遇到酸性环境后变成离子态, 返回外水相就受到了阻碍, 另一方面, 在溢出的NH3作用下(40 ～50 ℃温孵时为液晶态), 马钱子碱脂性增强而进入内水相与硫酸成盐, 保留在内水相, 使得其包封率大大高于被动载药, 但此法也仅限于弱碱性药物[8-9]。 有文献报道[10], 硫酸铵浓度对包封率影响显著,我们也观察到内水相随着硫酸铵溶液的浓度的逐渐增大, 包封率也随着增大, 但会有饱和趋势, 到达最大值后包封率会略有下降。

(2)关于处方因素中交互影响比较强烈, 正交设计实验预测的最佳提取参数与验证性结果相符。

(3)脂质体粒径的大小和Zeta 电位的研究, 是非均相体系稳定性考察的常规项目, 在防止脂质体微粒聚集、 融合, 以及脂质体与药物之间的作用方面有一定的作用。 我们通过高速剪切和挤出仪挤出的方法, 控制剪切次数和挤出孔径, 脂质体的稳定性获得了大大提高。