基于HS-SPME-GC-MS和GC-IMS结合电子鼻分析真空冷却对酱牛肉风味的影响

曹伟峰，张悦妍，向情儒，冯 涛,

（1.无锡市真正老陆稿荐肉庄有限公司，江苏 无锡 214016；2.上海应用技术大学香精香料技术与工程学院，上海 201418）

酱牛肉是我国传统特色的肉制品，其历史悠久，风味浓厚，有较高的营养价值，含有丰富的氨基酸、蛋白质等，深受人们的喜爱[1]。“陆稿荐”酱牛肉传承至今已有140余年的历史，以产品真材实料、风味独特、品质上乘和经营尚德诚信、勤勉创新、技艺专精久负盛名。酱牛肉的制作主要是解冻、分割、静腌、卤制、真空冷却等过程，其中，真空冷却至关重要。目前国内外酱牛肉主要通过真空冷却、自然冷却、高温冷却等多种冷却方式进行冷却。酱牛肉在自然冷却过程中，由于耗时长、降温速度慢等问题，可能会造成风味成分的损失，对其风味品质产生影响[2]。真空冷却技术作为高温食品快速冷却的高新技术之一，受到人们的广泛关注，与传统冷却技术相比其具有效率高、无残留、无污染等特点[3]。真空冷却技术最早用于蔬菜、鲜花的保藏，后广泛用于其他食品的加工生产，其目的在于延长食品货架期[4]。田欢等[5]的研究表明真空冷却的酱牛肉冷却速率较快，肉质颜色鲜艳。马志英等[6]的研究表明真空冷却肉制品不仅可以通过减少肉制品中微生物的增殖，提高肉制品质量，而且真空冷却肉制品的速度比自然冷却提高了20倍以上。

风味是衡量肉制品品质及整体可接受性的重要指标之一。对于酱牛肉风味品质的研究，大部分集中于对不同检测方法、不同品种酱牛肉的研究，而对于真空冷却技术的研究通常集中于食品保质期和质量安全方面[5]，对于真空冷却处理酱牛肉的风味研究较为少见。本研究通过顶空固相微萃取-色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）、气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）和快速气相色谱电子鼻等对自然冷却和真空冷却后的酱牛肉风味进行分析，为真空冷却调理肉制品提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

真正“陆稿荐”真空冷却酱牛肉、真正“陆稿荐”自然冷却酱牛肉 江苏省无锡市真正老陆稿荐肉庄有限公司，于0～4 ℃保存。

VCH-200 L低温型熟食品真空速冷机 江苏真正老陆稿荐肉庄有限公司；216 G绞肉机 广东省佛山HATTIECS；20 mL顶空瓶；50/30 μm DVB/CAR SPME萃取头 上海安谱实验科技股份有限公司；7890A/5975C气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦科技公司；Heracles II快速气相色谱电子鼻 法国Alpha M.O.S公司。

1.2 实验方法

1.2.1 真空冷却条件 参考文献[5]并加以改进，工作水温≤25 ℃，室内环境温度≤35 ℃，工作水压2 kg，真空箱容积1.3 m3左右，冷却终温10 ℃，冷却25 min。

1.2.2 样品前处理 酱牛肉去除表面冻卤和筋腱后，用实验室绞肉机搅碎至颗粒状，进行样品测定前称取1 g样品于20 mL顶空进样瓶中。

1.2.3 气相色谱质谱检测条件 SPME条件：30/50CAR/DVB/PDMS萃取头在250 ℃老化0.5 h，取3.0 g酱牛肉于20 mL顶空进样瓶中，于60 ℃水浴中吸附40 min，然后进行GC-MS分析。

GC条件：色谱柱为DB-WAX（UI）毛细管色谱柱，载气为氦气，流速为1.0 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流。柱升温程序：起始温度为40 ℃，以3 ℃/min升至130 ℃，保持3 min；再以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

MS条件：电子轰击离子源（electron impact ionsource，EI），电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，溶剂延迟时间5 min，全扫描模式，扫描质量范围为35～500 u。

定性与定量方法：挥发性物质鉴定结果以NIST 11谱库检索为准，保留匹配度大于60的成分；按峰面积归一化法计算各挥发性成分相对含量。

1.2.4 气相离子迁移色谱仪分析 顶空进样条件：准确称取1 g酱牛肉和酱排骨，装入20 mL顶空进样瓶中密封。在80 ℃条件下孵育15 min，孵化转速为500 r/min；进样温度85 ℃；进样体积为500 μL。

GC条件：色谱柱类型：MXT-5，柱长15 m，内径0.53 mm，膜厚1.0 μm；柱温60 ℃；分析时间20 min；载气：N2（纯度≥99.999%）；载气流速：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，10 mL/min；10～20 min，100 mL/min。

IMS条件：漂移管长度：5 cm；管内线性电压400 V/cm；漂移气：N2（纯度≥99.999%）；流速：150 mL/min；IMS温度：45 ℃。

1.2.5 气相电子鼻检测条件 本实验使用全自动超快速气相色谱电子鼻Heracles Ⅱ对两种酱牛肉进行检测。检测参数如表1所示。电子鼻的气相部分含有两根平行不同极性的色谱柱，其中，FID1是高极性色谱柱，FID2是中极性色谱柱。每个样品重复3次。

表1 气相电子鼻检测参数Table 1 Detection parameters of gas-phase electronic nose

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016对数据进行分析；利用仪器自带Laboratory Analytical Viewer、Gallery Plot和PCA等程序对酱牛肉挥发性物质进行分析，所有实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 酱牛肉挥发性风味物质分析

由表2可知，在真空冷却和自然冷却的酱牛肉中共检测到92种挥发性风味化合物，包括酯类19种、醇类20种、醚类3种、酮类13种、醛类11种、烃类12种、酸类8种、酚类2种和杂环类化合物4种，其中，自然冷却的酱牛肉中共检测到76种，真空冷却的酱牛肉中共检测到68种，共有化合物有54种。经不同冷却方式的酱牛肉挥发性成分种类及含量均有明显变化。在自然冷却的酱牛肉中，醇类和酯类物质相对含量最高，分别为52.84%和11.86%，而在真空冷却的酱牛肉中，相对含量最高的是醇类和酮类物质，分别为39.78%和30.53%。说明真空冷却的酱牛肉与自然冷却相比其新鲜度具有一定的优势，因为醛酮类物质可以反映熟肉的新鲜程度[7]。

表2 HS-SPME-GC-MS测得的挥发性化合物Table 2 Volatile compounds detected by HS-SPME-GC-MS

2.1.1 酯类挥发性化学物质含量分析 酯类化合物是一类重要的香气化合物，大部分具有果香、花香、蜜香等气味[8−9]。在自然冷却的酱牛肉中，酯类化合物中相对含量最高的物质是乙酸乙酯，其相对含量为6.63%，乙酸乙酯具有清新果香、酒香气味[10]。其次是乙酸己酯，其相对含量为1.22%，具有果味、甜味香气[11]。在真空冷却的酱牛肉中，相对含量最高的酯类化合物是乙酸己酯，相对含量为4.22%，其次为丙酸己酯，其相对含量为1.21%，具有甜果味气息。产生这个结果的原因可能与氧气对风味物质的影响有关，真空冷却的酱牛肉冷却速度快，与氧气接触时间短，避免了大部分酯化反应的发生。据此结果可以判断，真空冷却的酱牛肉在甜香味上略胜于自然冷却的酱牛肉，从而为真空冷却酱牛肉在选择酱汁上提供了一定的理论指导。

续表 2

续表 2

2.1.2 醇类挥发性化学物质含量分析 醇类化合物主要来源于脂肪氧化和Strecker反应，在两种处理方式的酱牛肉中相对含量高于其他类物质[12]。在自然冷却的酱牛肉中，相对含量最高的醇类化合物为异戊醇，其相对含量为15.59%，略带刺激性气味；其次是正己醇，相对含量为10.43%，具有淡青嫩叶气息，略带酒香、果香和脂肪气息等风味特征[13]。在经真空冷却的酱牛肉中，相对含量最高的分别为正己醇和1-辛烯-3-醇，相对含量分别为15.98%和11.55%，1-辛烯-3-醇属于不饱和醇，对香气有重要贡献，具有强烈的药草香韵，近似于玫瑰、薰衣草和干草的香气[14]。造成这种差异的原因可能是真空冷却的酱牛肉冷却速度比自然冷却快，减少了酱牛肉与氧气接触的时间。据此结果可以说明，真空冷却的酱牛肉在一定程度上减少了刺激性气味，增加了药草香味和果香味。

2.1.3 酮类挥发性化学物质含量分析 酮类化合物是由脂肪氧化和美拉德反应产生，具有清香、奶油及果香等令人愉快的气味[15]。氨基酸与还原糖之间发生的美拉德反应对气味的产生有重要贡献；脂肪自动氧化会产生不受欢迎的风味化合物，并导致酸败，但同时脂肪也可以作为一些芳香化合物的良好溶剂，或者作为风味形成反应的一部分，从而影响肉制品中风味的释放。在真空冷却的酱牛肉中，酮类化合物的相对含量占总挥发性化合物的30.53%，仅次于醇类化合物，而自然冷却的酱牛肉中酮类化合物的相对含量明显较低。在真空冷却的酱牛肉中含量最高的3-羟基-2-丁酮，在自然冷却的酱牛肉中相对含量仅为2.76%。3-羟基-2-丁酮具有甜味和奶油气味，造成这种差异的原因可能是因为在自然冷却酱牛肉的过程中，冷却时间较长，酮类物质作为底物被消耗了。

2.1.4 烃类挥发性化学物质含量分析 烃类化合物主要由脂肪酸中烷氧自由基均裂产生，是在熟牛肉和生牛肉中发现的做多的一类挥发性化合物，但是这类化合物阈值较低，对肉制品风味贡献并不大[16]。目前在牛肉中检测到大约200种烃类化合物种类，但在其他肉类中发现的烃类化合物种类要少得多。本实验在自然冷却的酱牛肉中检测到相对含量为3.05%的间二甲苯，有类似甲苯的气味，会使人产生不好的感受，而其在真空冷却的酱牛肉中其相对含量很低，仅为0.31%。月桂烯和苯具有香料、香脂气息，仅在真空冷却酱牛肉中检测到可能是因为真空冷却处理使酱牛肉在腌制过程中的香辛料气味在一定程度上得以更好地保留。

2.1.5 醛类挥发性化学物质含量分析 醛类化合物属氢过氧化物降解产物，阈值较低，对风味贡献比较大，尤其是短链醛对风味的贡献巨大[17]。但在本实验中两种处理方式的酱牛肉中醛类化合物的相对含量均不高，可能是因为醛类化合物大多具有较强的挥发性，在样品前处理及顶空固相微萃取操作中有一定程度的风味损失。在自然冷却的酱牛肉中己醛的相对含量最高，为1.57%，具有水果、鲜草气味。在真空冷却酱牛肉中相对含量最高的是壬醛，为1.07%，具有非常明显的果香味和脂肪香味[18]。

2.1.6 酸类挥发性化学物质含量分析 酸类物质可能是甘油三酯和磷脂的水解产物，也可能由醇和醛氧化产生。在自然冷却的酱牛肉中，乙酸是相对含量最高的酸类物质，达到3.70%。乙酸属于低级饱和酸，具有强烈刺激性气味[19]，也是人们不期望的气味，而在经真空冷却的酱牛肉中，乙酸未被检测到。

2.1.7 醚类、酚类、杂环类挥发性化学物质含量分析在两种处理方式加工的酱牛肉中，检测到醚类3种、酚类2种、杂环类化合物4种。在自然冷却的酱牛肉中，醚类化合物检测到3种分别为二丁醚0.63%、二乙二醇乙醚0.14%、茴香脑2.53%；在真空冷却酱牛肉中二乙二醇乙醚0.21%、茴香脑2.60%，二丁醚未被检测到，这可能是因为本身含量较少，在加工及前期处理过程中导致的风味损失。在两种酱牛肉中共检测到酚类化合物两种，其中，抗氧化剂BHT在真空冷却酱牛肉中相对含量为0.03%，而在自然冷却的酱牛肉中未被检测到，这可能是因为制作酱牛肉时添加的抗氧化剂在自然冷却过程中与空气接触时间较长被氧化造成的，说明真空冷却技术处理酱牛肉在一定程度上可以降低氧化速率，延长酱牛肉保质期。杂环类化合物如吡嗪类、呋喃类、嗯唑类等是由糖类与氨基酸发生美拉德反应所致，这类反应对肉类风味的形成起着至关重要的作用。吡嗪衍生物相对含量较少，但它们是一类存在于多种食物中的重要风味化合物，具有较强的感官特性，烷基吡嗪是由糖分解，α-β-丁二酮与氨基酸的Strecker降解反应形成氨基酮，氨基酮自身缩合和氧化形成[20]。烷基吡嗪是许多加热食品中经常出现的挥发物，但双环吡嗪是牛肉和烤牛肉中特有的香气化合物。在本实验中，自然冷却酱牛肉中2,5-二甲基吡嗪的相对含量为0.28%，在真空冷却酱牛肉中其相对含量为0.49%，2,5-二甲基吡嗪具有烤牛肉香味，这可能是因为真空冷却技术在一定程度上能够比自然冷却保留酱牛肉更多的特征挥发性化合物。

2.2 两种酱牛肉的气相-离子迁移谱分析

2.2.1 两种酱牛肉中挥发性化合物指纹图谱分析为了解析自然冷却的酱牛肉和真空冷却的酱牛肉之间挥发性化合物差异，采用仪器配套的Gallery Plot插件生成指纹图谱，见图1。

图1中的横向指示不同冷却方法处理的3个平行酱牛肉样品（从上到下分别是真空冷却的酱牛肉、自然冷却的酱牛肉），纵向指示不同冷却方式的酱牛肉中同一挥发性化合物（颜色越深，化合物含量与大）[21−22]。从图1的横纵向差异对比可见，不同冷却方法冷却的酱牛肉样品挥发性有机物存在较大的差异。其中，真空冷却的酱牛肉酮类物质含量增加，包括2-庚酮和2-戊酮；酯类物质含量增加，包括2-糠酸甲酯、正己酸乙酯等；苯甲醛含量增加；正己醇和四氢呋喃含量明显降低了。说明真空冷却增加了酱牛肉的甜香味和果香，降低了香精香料的损失，减少了刺激性味道的产生，这与前面不同冷却方式处理酱牛肉的GC-MS结果大致对应。

图1 不同冷却方法处理的酱牛肉中挥发性有机物的指纹图谱Fig.1 Fingerprint of volatile organic compounds in sauce beef treated with different cooling methods

2.2.2 两种酱牛肉挥发性有机物主成分分析 将两种酱牛肉的GC-IMS挥发性成分数据进行主成分分析（PCA），结果见图2。由图2所示，根据PCA结果，两个主成分的贡献率（PC1为68%；PC2为19%）占方差的87%，能反映出样品的总体特征[23−24]。真空冷却酱牛肉样品和自然冷却酱牛肉样品风味物质图谱相对集合，提示GC-IMS联合PCA分析可以对真空冷却酱牛肉和自然冷却酱牛肉进行分类。真空冷却的酱牛肉和自然冷却的酱牛肉在第一主成分和第二主成分上有明显差异，表明两种酱牛肉的味道差异较大，能够很好的区分出来，与图1不同冷却方法处理酱肉食品的指纹图谱成分变化规律结果大致对应。本文采用GC-IMS对真空冷却和自然冷却酱牛肉风味物质进行分析，结果具有可行性。

图2 两种酱牛肉中挥发性有机物的主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of volatile organic compounds in two kinds of sauce beef

2.3 两种酱牛肉挥发性物质的电子鼻分析

2.3.1 雷达特征图谱分析 根据图3气相电子鼻雷达图谱中峰的数量和大小，可以看到不同冷却方式处理的酱牛肉挥发性成分种类和含量分布情况。从两张雷达图中可以看到两种酱牛肉的整体风味轮廓大致相同，一些未重合的峰可能是只在一种酱牛肉中检测到的风味化合物。出峰面积不同可能是因为真空冷却处理增强了酱牛肉中的某些特征风味物质或者降低了一些因氧化而产生的酸败刺激性气味。这与HS-SPME-GC-MS挥发性化合物分析结果基本一致。

图3 电子鼻雷达特征图谱Fig.3 Characteristic radar spectrum of electronic nose

2.3.2 电子鼻的主成分分析 将本实验电子鼻数据做主成分分析，如图4所示。第一主成分的方差贡献率为95.713%，第二主成分的方差贡献率为4.128%，两个主成分的贡献率之和达到99.841%，能够很好地反映样品实际情况。同时，识别指数（discrimination index, DI）是用来表征样品之间区分度大小的一种判断方法，有效范围在80～100，且值越高说明得到的数据效果越好[25]。在本实验PCA分析中，识别指数达到99，说明自然冷却的酱牛肉和真空冷却的酱牛肉可以很好地区分出来，且效果较佳。在主成分分析中，样品之间相对距离越远，表明样品间气味差异越大[26]，从图中可以看出两种冷却方式处理的酱牛肉之间距离较远，在第一主成分方向显示出明显的分离，表明两种酱牛肉气味差异较为显著，可以被很好地区分。

图4 PCA分析Fig.4 PCA analysis

3 结论

本实验采用HS-SPME-GC-MS和气相电子鼻对自然冷却和真空冷却的酱牛肉中挥发性化合物进行了分析，两种酱牛肉中共检测到92种挥发性风味化合物，其中，自然冷却的酱牛肉中共检测到76种，真空冷却的酱牛肉中共检测到68种，包括酯类、醇类、醚类、酮类、醛类、烃类、酸类、酚类和杂环类化合物。结果表明，真空冷却能够在一定程度上减少酱牛肉在自然冷却过程中产生的一些具有刺激性气味的化合物，如乙酸、异戊醇等，同时增加了甜香味。真空冷却的酱牛肉在保留香辛料气味方面比自然冷却的酱牛肉更有优势，且两种不同冷却方式处理的酱牛肉气味存在差别，可以通过快速气相色谱电子鼻进行快速鉴别。本研究为真空冷却调理肉制品研究提供了一定的理论基础。